[发明专利]一种莱茵衣藻重金属镉吸附突变体的筛选方法

权利要求书

1.一种莱茵衣藻重金属镉吸附突变体的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包括：

根据不同氯化镉浓度对莱茵衣藻生长的影响，选择合适的重金属镉吸附突变体筛选浓度；

电击转化获得莱茵衣藻突变体；

筛选出莱茵衣藻重金属镉吸附突变体；所述筛选出莱茵衣藻重金属镉吸附突变体包括筛选重金属镉敏感型突变体和筛选重金属镉抗性突变体；

鉴定筛选出的莱茵衣藻重金属镉吸附突变体的突变基因。

2.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述根据不同氯化镉浓度对莱茵衣藻生长的影响，选择合适的重金属镉吸附突变体筛选浓度，包括：

培养莱茵衣藻；

配置固体TAgP氯化镉浓度呈梯度的培养基；

将培养好的莱茵衣藻分别置于所述固体TAgP氯化镉浓度呈梯度的培养基中，根据莱茵衣藻在不同浓度呈梯度的培养基中的生长状况，选择重金属镉敏感型突变体筛选浓度和重金属镉抗性突变体筛选浓度。

3.如权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述配置固体TAgP氯化镉浓度呈梯度的培养基，具体为：

向TAgP中加入不同浓度梯度的氯化镉，具体浓度为0mM,、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM。

4.如权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，所述根据莱茵衣藻在不同浓度呈梯度的培养基中的生长状况，选择重金属镉敏感型突变体筛选浓度和重金属镉抗性突变体筛选浓度，具体为：

将培养好的野生型莱茵衣藻21gr分别滴在不同氯化镉浓度梯度TAgP固体培养基上，培养五天后，观察记录，根据具体结果，选取0.4mM氯化镉作为用于筛选重金属镉敏感型突变体的筛选浓度和0.6mM氯化镉作为用于筛选重金属镉抗性突变体的筛选浓度。

5.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述电击转化获得莱茵衣藻突变体，包括：

制备aphⅧ目的片段；

配备经过过滤除菌的0.4％PEG6000和以TAP为基础的培养基和预设细胞浓度的莱茵衣藻；

制备莱茵衣藻感受态细胞；

电击获得莱茵衣藻突变体；

细胞涂板；

挑取细胞转化子。

6.如权利要求5所述的筛选方法，其特征在于，所述制备aphⅧ目的片段，具体包括：

通过构建的质粒pJMG-aphⅧ，所述质粒pJMG-aphⅧ含有Paro抗生素筛选的DNA片段(aphⅧ)；采用EcoRⅠ酶切，胶回收aphⅧ片段；

预设细胞浓度的莱茵衣藻包括：将莱茵衣藻21gr在TAP吹气瓶中培养至对数期后，转接到200mL的三角瓶中，置于摇床培养8-16小时，以200rpm的转速并连续光照；直至细胞浓度为4x10⁶cells/ml。

7.如权利要求5所述的筛选方法，其特征在于，所述电击获得莱茵衣藻突变体，包括：

在电击杯中加入250ul衣藻感受态细胞和aphⅧ目的片段100-200ng；在电击仪BTX ECM630进行电击，电击最佳时间为10ms到14ms；电击完毕后，立即将电击杯放置冰上，静置5-10min；其中，在制备衣藻感受态细胞和电击转化过程中，需要保持细胞处于无菌状态。

8.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述鉴定筛选出的莱茵衣藻重金属镉吸附突变体的突变基因，包括：

利用RESDA-PCR技术获取插入片段及其侧翼DNA；

获取侧翼基因信息。

9.如权利要求8所述的筛选方法，其特征在于，所述利用RESDA-PCR技术获取插入片段及其侧翼DNA，具体包括：所述RESDA-PCR其中一端的引物由简并性引物，一段特定序列Q0和四种限制性内切酶特异识别序列组成；另一端是以插入片段上的一段序列作为引物；对RESDA-PCR两端的引物进行扩增，得到大量带有限制性内切酶序列和插入片段上特定序列Q0组合的扩增产物，将所述扩增产物稀释25倍作为模板，以特定序列Q0和插入片段上已有序列作为引物，进行第二轮扩增，得到的扩增产物包含插入片段及其侧翼基因。

10.如权利要求9所述的筛选方法，其特征在于，所述获取侧翼基因信息，具体包括：

所述扩增产物经过DNA电泳跑胶后，切胶回收500bp以上的片段，进行测序；

将测序结果与插入片段进行序列比对，鉴定出扩增产物是否包含插入片段；

查询插入片段以外的序列，获得突变基因序列。