[发明专利]一种蛋白质甲基化的分析处理方法及其应用

说明书

本发明涉及一种蛋白质甲基化的分析处理方法，利用甲基化修饰的赖氨酸和精氨酸会抑制胰蛋白酶的酶切这一特性，发展了一种综合了重标甲硫氨酸细胞培养氨基酸稳定同位素标记(heavy methyl stable isotope labeling by amino acids in cell culture，hM‑SILAC)，多酶酶切和强阳离子交换微柱(SCXtip)分离的样品处理方法，并将其应用于甲基化蛋白质组的规模化分析中。通过结合多酶酶切策略，有效的降低了非甲基化来源的漏切位点，并通过高pH范围的强阳离子交换色谱的分离策略，有效的克服了含有组氨酸的肽段的干扰。从而极大的提高了甲基化肽段的分离特异性。

技术领域

本发明属于蛋白质组学研究方向甲基化蛋白质组学技术领域，具体涉及蛋白质甲基化的分析处理方法及其应用。

背景技术

蛋白质的甲基化修饰是由S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine，SAM)依赖的甲基转移酶催化产生的，是最常见的蛋白质翻译后修饰之一。甲基化修饰在很多的生理过程的调控中发挥着重要的调控作用。研究表明：蛋白甲基化可以调节目标蛋白分子内或分子间的相互作用；影响它们和RNA的亲和作用，从而影响着多种细胞进程，包括转录调节、细胞定位、核糖体装配、RNA加工、不均一核糖核酸核糖体蛋白(hnRNPs)的成熟、蛋白-蛋白相互作用、翻译的准确性、细胞核运输、蛋白核酸运输和代谢以及细胞内信号传导等。由于甲基化的多样性及复杂性，在蛋白质组学水平上鉴定甲基化位点仍然十分的困难，这主要是因为蛋白质中甲基的引入除了增加甲基化氨基酸残基的空间位阻和减少氨基酸残基的氢键作用力外，并没有显著改变氨基酸残基的净电荷或者等电点，这使得甲基化蛋白质/肽段的高效分离富集比较困难，极大的影响了分析的灵敏度。

发生甲基化修饰后的赖氨酸残基和精氨酸残基的碳端(C端)不容易被胰蛋白酶(trypsin)识别而导致漏切。因为甲基化修饰不会改变赖氨酸残基和精氨酸残基的带电性质，这些漏切肽段会比普通的酶切肽段多带一些正电荷，因而可以利用低pH范围的离线(off-line)SCX分离策略对这些甲基化肽段进行分离(文献1.Uhlmann,T.；Geoghegan,V.L.；Thomas,B.；Ridlova,G.；Trudgian,D.C.；Acuto,O.Mol Cell Proteomics 2012,11,1489-1499)。但是在低pH范围的SCX色谱分离条件下，非甲基化的漏切肽段和含有组氨酸的肽段也会多带一些正电荷，因而会对甲基化肽段的高效分离造成干扰。据报道，在甲基化肽段比较集中的SCX馏分中，含有组氨酸的肽段会占到了全部肽段的60-70％，极大的影响了分离的特异性。

本发明首次利用高pH范围的强阳离子交换色谱(strong cation exchangechromatography，SCX)分离的思路，借助于重标甲硫氨酸细胞培养氨基酸稳定同位素标记技术(heavy methyl stable isotope labelling by amino acids in cell culture，hM-SILAC)和多酶酶切技术，显著提高了鉴定的可信度，并降低了分离过程中非甲基化肽段的干扰，从而实现了甲基化蛋白质组学样品的高通量分析。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高通量的集SCXtip分离技术，重标甲硫氨酸细胞培养氨基酸稳定同位素标记技术和多酶酶切技术于一体的甲基化蛋白质组样品处理方法。

本发明提出的甲基化蛋白质组样品的综合分析方法，利用了甲基化修饰后的赖氨酸和精氨酸不容易被胰蛋白酶酶切而导致漏切这一特性，实现了基于SCXtip的甲基化蛋白质组学的分离和分析。

本发明采用的技术方案为：

一种蛋白质甲基化的分析处理方法：

(1)利用重标甲硫氨酸细胞培养氨基酸稳定同位素标记技术将蛋白质中的赖氨酸和精氨酸上的甲基化修饰基团进行重标标记；