[发明专利]一种蛋白质甲基化的分析处理方法及其应用

权利要求书

1.一种蛋白质甲基化的分析处理方法，其特征在于：

(1)利用重标甲硫氨酸细胞培养氨基酸稳定同位素标记技术将蛋白质中的赖氨酸和精氨酸上的甲基化修饰基团进行重标标记；

(2)对步骤(1)得到的重甲基化修饰后的蛋白质进行多酶酶切处理，所述多酶为胰蛋白酶、赖氨酸酶和精氨酸酶；

(3)对步骤(2)得到的蛋白质酶解液进行离心辅助的基于强阳离子交换微柱(SCXtip)的甲基化肽段分离，微柱分离时，清洗剂为78％-82％乙腈，勃-罗二氏缓冲溶液(Britton&Robinson Universal Buffer，BRUB)，清洗剂pH值为8.5-9.5，以降低组氨酸肽段的干扰，得到甲基化蛋白质组。

2.根据权利要求1所述的分析处理方法，其特征在于：

步骤(1)具体操作为，将细胞在含有重标甲硫氨酸的DMEM培养液中培养，得到的细胞于裂解液中超声辅助破碎。

3.根据权利要求1所述的分析处理方法，其特征在于：

所述勃-罗二氏缓冲溶液包括磷酸、硼酸和醋酸，勃-罗二氏缓冲溶液用氢氧化钠溶液调节pH值；

所述多酶酶切处理是指向重甲基化修饰后的蛋白质中加入胰蛋白酶、赖氨酸酶和精氨酸酶进行酶解。

4.根据权利要求2所述的分析处理方法，其特征在于：

所述细胞培养的体系是含有0.2mM的L-Methionine-(methyl-13C,D3)的DMEM培养基，并加入10％的透析处理的胎牛血清；

所述细胞裂解液的体系是含有8M尿素，1％v/v聚乙二醇辛基苯基醚，65mM二硫苏糖醇，1mM苯甲基磺酰氟，1％v/v蛋白酶抑制剂，50mM Tris-ClpH 7.5的缓冲溶液。

5.根据权利要求1所述的分析处理方法，其特征在于：

步骤(2)中多酶酶切处理的操作步骤为：向重甲基化修饰后的蛋白质中加入终浓度为10-20mM二硫苏糖醇，37-60℃水浴中1-3h，然后加入终浓度为20-40mM碘代乙酰胺，20-25℃避光反应40-60min，通过超滤辅助酶解策略将溶液置换为50mM碳酸氢铵，pH 8.0，按照蛋白：酶质量比为50:1加入胰蛋白酶(trypsin)和赖氨酸酶(lys-C)，在37℃条件下酶解16小时，经超滤处理去除胰蛋白酶(trypsin)和赖氨酸酶(lys-C)，然后添加10×活化溶液至1×，按照蛋白：酶质量比为50:1加入精氨酸酶(arg-C)，在37℃条件下酶解16小时，其中活化溶液为50mM pH 7.6–7.9Tris-HCl，50mM二硫苏糖醇(DTT)和2mM乙二胺四乙酸(EDTA)。

6.根据权利要求3所述的分析处理方法，其特征在于：

所述氢氧化钠溶液用氢氧化钠溶解于水中制成；BRUB溶液的浓度为5mM，包括5mM磷酸、5mM硼酸和5mM醋酸，用1M氢氧化钠溶液调pH值至8.5-9.5。

7.根据权利要求1所述的分析处理方法，其特征在于：

步骤(3)中所述离心辅助中离心机的离心力为1000g-3000g；强阳离子交换微柱(SCXtip)为填充了强阳离子交换色谱材料的以脱脂棉为塞板的枪头。

8.根据权利要求1所述的分析处理方法，其特征在于：

步骤(3)具体操作为：将步骤(2)中得到的蛋白质上样到SCXtip中，利用200μL清洗液洗2-5次，所述清洗液为78％-82％乙腈，勃-罗二氏缓冲剂，pH 8.5-9.5，以降低组氨酸肽段的干扰，再分别利用200μL的一系列洗脱溶液来洗脱结合的甲基化多肽，洗脱溶液分别为60％乙腈，5mM勃-罗二氏缓冲剂，pH 9；60％乙腈，5mM勃-罗二氏缓冲剂，pH 10；60％乙腈，5mM勃-罗二氏缓冲剂，pH 11；30％乙腈，5mM勃-罗二氏缓冲剂，pH 12；5mM勃-罗二氏缓冲剂，pH12，1M氯化钠；分别收集各洗脱馏分并进行除盐处理，将所得甲基化肽段室温下冻干，得处理后的甲基化蛋白质组。