[发明专利]一种噬菌体辅助的多细菌连续定向进化系统和方法

说明书

本发明公开了一种噬菌体辅助的多细菌连续定向进化系统和方法，该系统中包含携带待进化目的基因的噬菌体SM，支持进化前后不同SM增殖的多种辅助质粒HP和诱导突变的质粒IP。不同HP被放置在不同宿主菌中，可以有效提高噬菌体的增殖与进化效率，同时避免不同基因元件间的相互干扰，具有较好的实用性，可以用于多种基因的定向进化。

技术领域

本发明涉及生物进化领域，尤其涉及一种噬菌体辅助的多细菌连续定向进化系统和方法。

背景技术

定向进化(也称实验室进化)是一种强有力的技术方法，它可以通过驾驭生物进化过程，产生具有指定功能的生物分子。所产生的生物分子已广泛应用于工业生产、生物工程、医药开发等诸多领域。哈佛大学David R Liu实验室开发了一种基于噬菌体生长的连续进化系统(噬菌体辅助持续进化，PACE)。它主要包含SM、HP、IP三个模块：噬菌体模块(SM)：噬菌体M13基因中包装以及侵染宿主菌所需的gIII基因被切除，插入待进化生物分子的基因，其中噬菌体缺少gIII后，无法侵染宿主产生子代噬菌体；诱变模块(IP)：利用阿拉伯糖作为诱导物诱导DNAQ926、dam和seqA表达，使DNA复制过程中聚合酶引入的错误碱基不能被切除，提高突变率，由阿拉伯糖诱导的IP使噬菌体的突变速率提高几百倍；辅助模块(HP)：含有噬菌体侵染宿主细胞进行繁殖所需的gIII基因，通过将HP上gIII的表达与SM上待进化目的基因的生物活性绑定在一起(比如要使某RNA聚合酶向特定方向进化，则利用与进化方向一致的启动子来控制gIII的表达)，来决定各突变SM能否产生具有感染活性的子代噬菌体SM。本发明中，SM或其突变株能(或不能)启动gIII基因表达指的就是SM或其突变株上的待进化目的基因能(或不能)启动gIII基因表达。

在进化池中，携带待进化野生型目的基因的噬菌体侵染宿主细胞时，将其遗传物质野生型SM注入宿主菌，利用宿主菌内的复制系统进行遗传物质的复制。与此同时，在阿拉伯糖的诱导下，宿主细胞内IP上的DNAQ926、dam和seqA表达，导致SM产生突变。若SM获得的突变(即SM上目的基因突变)可以启动gIII蛋白的表达，则可以产生具有侵染性的子代噬菌体。这些新产生的子代噬菌体突变株SMe分泌到宿主菌外，去感染新的宿主菌，进行下一轮复制增殖。由此那些能够启动gIII表达的SMe突变株就可以不断地增殖，提高自身数量，而那些野生型的SM和不能启动gIII表达的突变SM则不能分泌子代噬菌体进行增殖，其数量不会提高。这时如果以一定的速度向进化池中不断添加新的宿主菌培养物并排出旧培养物，则那些不能启动gIII表达或者表达能力低的野生型SM及其突变株很快就会被洗脱出去，而那些可以高效启动gIII表达的SMe突变株则最终会被保留下来。

由于只有进化后的SMe能够启动gIII表达并进行增殖，初始的野生型SM则不能，它会被直接洗脱掉。但SM的进化与筛选需要在SM的增殖过程中才能进行，所以在这种情况下，SM的进化效率变的极低。针对这种情况的一个解决方案是，向宿主菌中引入两个辅助模块HP1(或HP1.1)、HP2。HP1上的gIII可以直接被野生型SM启动表达，HP2上的gIII则只能被进化后SMe启动gIII表达。这样野生型SM可以通过启动HP1上的gIII表达来支持自身的增殖，并在增殖过程中进行突变进化，从而进化出能够启动HP2上的gIII表达的SMe。得到的SMe可以通过其他途径进行下一步的进化筛选。

在实际应用中，这种野生型SM所识别启动的HP1和被进化后的SMe所识别启动的HP2同时存在于一个宿主菌中的进化系统使用效果并不理想。HP1和HP2在功能、表达方式上相似度很高。它们同时出现在一个宿主菌中时，会出现严重的相互干扰现象。这时经常会出现初始加入的野生型SM对HP1和HP2上的gIII基因表达的启动效果变得都很低，甚至出现HP1和HP2上的gIII均难以被启动表达的现象，从而使得定向进化难以进行。

发明内容