[发明专利]用于TRV介导的基因沉默体系中的指示基因及其载体的构建方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种指示基因载体、构建方法和用途。

背景技术

病毒介导的基因沉默（virus-induced gene silencing, VIGS）是研究植物基因功能的一种重要方法，具有简便、快速高效、不需要对植物进行复杂遗传转化和可以对致死基因进行功能研究等特点。近年来，多种VIGS载体相继得到开发并在多种植物中得到广泛的应用。其中，烟草脆裂病毒（TRV）是目前应用最广泛的VIGS载体，它是由TRV1与TRV2两条RNA病毒链组成，TRV1用于辅助载有靶基因片段的TRV2在植物体内移动。TRV作为病毒载体有诸多优点，比如病毒症状较轻、沉默效率高且持久、各种组织均可产生沉默等，因而被广泛应用。尤其是Liu等人改进后的烟草脆裂病毒载体TRV2（pYL156和pYL279），在载体中插入了双倍CaMV35S启动子，在C端插入了1个核酶，可导致更有效的病毒RNA产生；而且也拓展了应用范围，除了应用在本氏烟和茄属的2个种外，还适用于番茄、烟草、辣椒等作物。

类胡萝卜素是一类由异戊二烯组成的萜类化合物，在动植物中都有重要的生理功能和生物活性。类胡萝卜素在植物光合作用中担负着光吸收的辅助色素的重要功能，主要存在于植物叶片的叶绿体以及许多花和果实的有色体中，具有吸收和传递电子的能力，并在清除光合作用中产生的叶绿素三线态和单线态及超氧阴离子等自由基方面起着重要的作用。通常的，在TRV-VIGS实验中，TRV1-TRV2（TRV）菌液混合注射作为阴性对照，TRV1-TRV2-PDS（TRV-PDS）菌液混合注射作为阳性对照。八氢番茄红素脱氢酶（PDS）是类胡萝卜素合成通路上一个关键基因，具有保护叶绿素免受光漂白的作用。PDS基因发生沉默后, mRNA转录水平显著降低，导致类胡萝卜素合成途径被阻断，从而使被侵染植物新生叶片表现出白化效应，可以直观的用肉眼观察，常被作为各种病毒VIGS体系的指示基因，来验证VIGS体系在植物中沉默成功。

ζ-胡萝卜素脱氢酶（ZDS）基因是类胡萝卜素生物合成途径中又一重要基因，紧邻PDS基因下游，主要参与线状类胡萝卜素的生物合成，催化ζ-胡萝卜素向番茄红素的转化，促进分支途径其他类胡萝卜素的合成。ZDS基因作为TRV介导的VIGS体系的指示基因在国际上还未见报道。

发明内容

本发明提供了一种可用于TRV病毒介导基因沉默体系中的指示基因载体及其应用，并公开了该指示基因载体的构建方法。

本发明的技术方案是：用于TRV介导的基因沉默体系中的指示基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

用于TRV介导的基因沉默体系中的指示基因载体的构建方法，它的步骤如下：

（1）以普通烟草红花大金元旺长期幼叶cDNA为模板进行PCR扩增，测序得到普通烟草ZDS编码区全长序列1785 bp，共编码594个氨基酸；

（2）分别以ZDS-F和ZDS-R为引物，以红花大金元旺长期幼叶片cDNA为模板进行PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶提取试剂盒从琼脂糖凝胶上纯化目标ZDS DNA 片段，纯化的ZDS DNA片段与pMD19-T载体连接，在42 ℃的条件下热激转化90s入大肠杆菌DH5α，从得到的克隆转化子中用菌落 PCR鉴定阳性克隆，提取阳性克隆质粒ZDS-T；

（3）以ZDS基因5′端782-1414的633 bp的基因片段作为VIGS体系特异性核酸沉默片段，选取KpnI和XhoI限制性酶切位点设计引物，以ZDS-T质粒为模板进行PCR扩增，回收纯化 PCR 产物，使用KpnI和XhoI酶切 PCR 回收片段和 TRV2病毒载体，回收目的片段并连接，连接液转化细菌，构建TRV2-ZDS VIGS载体。

3. 根据权利要求2所述的用于TRV介导的基因沉默体系中的指示基因载体的构建方法，其特征在于：所述步骤（2）中ZDS-F和ZDS-R引物序列如下：

ZDS-F：5′-ATGGCTACTTCTTCAGCTTATCTTTG-3′

ZDS-R：5′-TCAGACAAGACTCAACTCATCAGATAC-3′。

所述的用于TRV介导的基因沉默体系中的指示基因载体的构建方法，所述步骤（3）中KpnI和XhoI限制性酶切位点引物序列如下：