[发明专利]一种高产没食子酸脱羧酶(GAD)菌种筛选及降解没食子酸制备焦性没食子酸的方法

说明书

一、技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及微生物降解没食子酸制备焦性没食子酸的方法。 

二、背景技术

五倍子富含没食子单宁，由没食子酸与不同构型的葡萄糖结合的混合物，以五倍酰葡萄糖为核心，在C2、C3、C4位以缩酚键连接不同数目的倍酰基结构。没食子单宁通过化学法水解或生物法在单宁酶(tannase)的作用下发生降解生成没食子酸；没食子酸再经过化学法脱羧或在没食子酸脱羧酶(gallic acid decarboxylases，GAD)的作用下发生脱羧反应生成焦性没食子酸(如图1所示)。焦性没食子酸(1，2，3-三羟基苯)作为一种多元酚，在工业上具有广泛的用途。在摄影行业中，焦性没食子酸可以作为显影剂使胶片成像；在燃料工业上，焦性没食子酸与二羟代苯砜缩合产物是染制皮毛、皮革的优良染料；在医药工业中，焦性没食子酸可作为辅酶-Q10的抗氧化稳定剂，是重要的医药中间体；分析化学中，在重量分析上用以测定铋及锑，并用作磷钨酸的还原剂，红外线照相术的热敏剂，也是煤气、烟道气、炼焦煤气、水煤气等气体的除氧剂。 

目前工业上主要通过化学法，将没食子酸在在6N HCl的作用下催化脱羧生产焦性没食子酸，但由于产生大量高浓度盐和高色度的废酸水，造成严重的环境污染问题和设备腐蚀等问题，急需开发环境友好和反应温和的微生物制备新工艺，关键在于产高活性没食子酸脱羧酶菌株及其降解工艺的优选。由于相较化学法，利用GAD来降解没食子酸生产焦性没食子酸的收率并不高，国内的研究基本上属于空白，国外虽然早在上世纪60年代就有相应的研究，但目前已发现可有高效降解效果的菌株仍然很少，但目前已发现可有高效降解效果的菌株仍然很少，诸如克雷伯氏菌(K.aerogenes)、产气肠杆菌(E.aerogenes)、肠杆菌属(E.sp.)、弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii)、成团泛菌(P.agglomerans)、氧化还原真杆菌(E.oxidoreducens)、植物乳杆菌(L.planetarium)、解没食子酸链球菌(S.gallolyticus)、黏红酵母菌(R.glutinis)等。研究发现，某些微生物菌种可以产生脱羧酶而将多羟基苯甲酸羧基脱去；某些微生物菌种可以在特定的培养基上产生高活性没食子酸脱羧酶(GAD)，将没食子酸降解成焦性没食子酸。Hajim等利用柠檬菌 株(C.sp.64-1)，在厌氧条件下降解没食子酸生产焦性没食子酸，产率达到97.4％。Kumar等采用固定柠檬酸杆菌(C.freundii)生物反应，进行连续发酵没食子酸，焦性没食子酸的产率达到98.5％。Soni等从印度Rfjasthan地区的土壤中利用EDAE纤维素离子交换柱和交联葡萄糖G-50凝胶过滤色谱分离得到了一种肠杆菌(E.spp.)，该细菌可以产高活性没食子酸脱羧酶(GAD)，焦性没食子酸产率14.48％。Spiros等利用基因工程菌将葡萄糖生物合成没食子酸和焦性没食子酸，来代替生物催化生产焦性没食子酸的方法，产率可达93～97％。Grant利用产气杆菌研究了非氧化脱羧酶对多羟基苯甲酸的脱羧作用及部分脱羧酶的性质，主要是邻苯二酚、间苯二酚母核结构型多羟基苯甲酸和氨基苯甲酸的脱羧，微生物为黑曲霉菌、产气杆菌、假单胞菌、大肠杆菌等。目前已从多种细菌中分离得到没食子酸脱羧酶，如成团泛菌(P.agglomerans T71)、柠檬酸杆菌(C.freundii TB3)、柠檬酸杆菌(C.sp.64-1)、肠杆菌属(E.Spp)，除细菌外还发现一株酵母菌(R.Glutinis)也可以产生没食子酸脱羧酶。 

三、发明内容

本发明的目的在于将负压空化和负压微波喷雾干燥技术应用于中药五倍子提取中，通过对负压空 

本发明的目的在于提供一种高产没食子酸脱羧酶(GAD)菌种筛选及降解没食子酸制备焦性没食子酸的方法，本发明的技术方案是采用如下步骤来实现： 

第一步，培养基制备 

(1)种子培养基称取蛋白胨5.0g、牛肉浸取物3.0g、NaCl5.0g在1L容量瓶，加蒸馏水定容至刻度，用1mol/L盐酸将pH值调至6.5～7.0，在121℃下灭菌20min，冷却后为种子培养基； 

(2)试管斜面保藏培养基称取蛋白胨5.0g、牛肉浸取物3.0g、NaCl5.0g、琼脂15.0g，在1L容量瓶，加蒸馏水定容至刻度，用1mol/L盐酸将pH值调至6.5～7.0，在121℃下灭菌20min，冷却后为试管斜面保藏培养基；