[发明专利]一种高产没食子酸脱羧酶(GAD)菌种筛选及降解没食子酸制备焦性没食子酸的方法

权利要求书

1.一种高产没食子酸脱羧酶(GAD)菌种筛选及降解没食子酸制备焦性没食子酸的方法，其特征在于由以下步骤组成：

第一步，培养基制备

(1)种子培养基称取蛋白胨5.0g、牛肉浸取物3.0g、NaCl5.0g在1L容量瓶，加蒸馏水定容至刻度，用1mol/L盐酸将pH值调至6.5～7.0，在121℃下灭菌20min，冷却后为种子培养基；

(2)试管斜面保藏培养基称取蛋白胨5.0g、牛肉浸取物3.0g、NaCl5.0g、琼脂15.0g，在1L容量瓶，加蒸馏水定容至刻度，用1mol/L盐酸将pH值调至6.5～7.0，在121℃下灭菌20min，冷却后为试管斜面保藏培养基；

(3)发酵培养基成团泛菌发酵培养基：0.3％没食子酸、0.5％丙三醇、0.5％蛋白胨、0.001％FeSO₄.7H₂O、0.1％KH₂PO₄、0.05％MgSO₄·7H₂O、1.0％酵母提取物；弗氏柠檬酸杆菌发酵培养基：2.0％没食子酸、0.2％(NH₄)₂HPO₄、0.1％KH₂PO₄、0.05％MgSO₄·7H₂O、0.05％酵母提取物；克雷伯氏菌发酵培养基：1.0％没食子酸、3.0％C₁₃H₁₅N₃O₂(4-氨酰安替比林)、2.0％(NH₄)₂SO₄、0.8M饱和Na₂B₄O₇·10H₂水溶液、0.5M Na₂HPO₄·12H₂O缓冲溶液(pH7.2可由12.535g Na₂HPO₄·12H₂O或者4.969g Na₂HPO₄与2.340g NaH₂PO₄·2H₂O溶于100mL蒸馏水制得)；氧化还原真杆菌发酵培养基：30mM C₆H₇O₈Na、30mM HCOONa·2H₂O、1％细菌琼脂粉、0.2％没食子酸；植物乳杆菌、解没食子酸链球菌发酵培养基：包含5.0％去纤维蛋白的马血、20mM没食子酸的肉汤培养基；黏红酵母菌发酵培养基：0.5％C₆H₁₂O₆、0.9％NaCl、0.5mM没食子酸、0.5％酵母提取物；肠杆菌属、产气肠杆菌属发酵培养基：0.06％MgSO₄·7H₂O、0.4％(NH₄)₂SO₄、0.2％～0.5％没食子酸、0.5％麦芽糖并取30mM pH值为6.0～7.0的磷酸盐缓冲溶液，其中没食子酸于100℃下灭菌5min，麦芽糖于115℃下灭菌30min，其余成分在121℃下灭菌20min，制备发酵培养基；

第二步，没食子酸脱羧酶(GAD)的高产菌种筛选

初筛的方法：将培养好的克雷伯氏菌(K.aerogenes)、产气肠杆菌(E.aerogenes)、肠杆菌属(E.sp.)、弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii)、成团泛菌(P.agglomerans)、氧化还原真杆菌(E.oxidoreducens)、植物乳杆菌(L.planetarium)、解没食子酸链球菌(S.gallolyticus)、黏红酵母菌(R.glutinis)等菌液，分别放入相应的发酵培养基中培养发酵，如肠杆菌属(E.sp.)、产气肠杆菌(E.aerogenes)的发酵培养基如第一步中所示，温度30～37℃，每隔12h取样一次，然后取用3倍体积的乙醚萃取发酵液3次，合并萃取液，减压浓缩，制备乙酸乙酯萃取物，经TLC和HPLC分析没食子酸和焦性没食子酸，筛选出高产没食子酸脱羧酶(GAD)的产气肠杆菌(E.aerogenes)、肠杆菌属(E.sp.)、弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii)、解没食子酸链球菌(S.gallolyticus)和黏红酵母菌(R.glutinis)；

第三步，菌种底物诱导

配制CDM缺碳培养基：0.06％MgSO₄·7H₂O、0.4％(NH₄)₂SO₄、0.2％没食子酸及30mM pH值为6.6的磷酸盐缓冲溶液，将培养好的斜面菌种以无菌操作取两环，转接到100mL CDM培养基的250mL摇瓶中，在水浴温度为25～30℃，转速为180～200r/min的摇床中培养，每12h取样一次，HPLC检测发酵液中没食子酸和焦性没食子酸；

第四步，种子液制备及发酵培养

将培养好的斜面菌种以无菌操作取五环，转接到100mL发酵培养基的250mL摇瓶中，温度30～40℃，静置培养6～8h，将培养好的菌液按照4～6％接种量，转接到发酵培养基中，温度30～35℃，180～200r/min摇床培养50～70h；

第五步，摇瓶生理胁迫培养及响应面优化

通过考察接种量、发酵时间、磷酸盐浓度、底物浓度、发酵温度、发酵液起始pH值等因素对焦性没食子酸的收率的单因素影响，采用Box-Behnken实验设计进行3因素(底物浓度、发酵温度、发酵液起始pH值)3水平的响应面优化，并进行验证；

第六步，发酵液中焦性没食子酸提取

取第五步最佳工艺条件下发酵液原液，于6000r/min条件下离心20min，取上清液用其体积3倍的有机溶剂萃取3次，合并萃取相、浓缩，得焦性没食子酸浓缩物；

第七步，中压柱分离制备

将焦性没食子酸浓缩物与中压柱填料按质量比1∶10～30吸附，洗脱剂为甲基叔丁基醚、正丁醇、乙酸乙酯、甲醇、乙醇和水中的1种或几种的混合溶液，中压柱柱长20～300cm，柱直径2～30cm，柱压为3～10MPa，检测波长220～360nm，流速2～100mL/min，富集焦性没食子酸，室温真空回收溶剂，经HPLC分析，制备得到98％以上焦性没食子酸。