[发明专利]一种手性纯S-乙偶姻的生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种手性纯S-乙偶姻的生产方法，具体说是将丁二酮还原酶基因dar和葡萄糖脱氢酶基因gdh在大肠杆菌中表达，并以此重组大肠杆菌休止细胞为生物催化剂，以丁二酮和葡萄糖为底物高效生产手性纯S-乙偶姻的方法。

背景技术

乙偶姻(acetoin)具有明显的奶酪香、脂香特征，天然地存在于玉米、葡萄、苹果、草莓、黄油、干酪、酒类、可可等各类食品中，国家标准GB2760-86规定其为允许添加食用的食品香料。乙偶姻主要用于奶油、乳品、咖啡、酸奶等香料的生产。此外，乙偶姻是一种重要的化学合成中间体，2004年美国能源部将乙偶姻列为30种优先开发利用的平台化合物之一，可广泛应用于食品、制药、化工等领域。乙偶姻有两种旋光异构体(S-乙偶姻和R-乙偶姻)，除了上述应用之外，具有立体结构专一性的手性乙偶姻还有特殊的用途，例如合成手性液晶复合材料。在制药工业中，手性乙偶姻可作为前体合成重要药物中间体，如4-氯-4,5-二甲基-1,3-二氧杂环戊烷-2-酮(CDMDO)和4-溴甲基-5-甲基-1,3-二氧戊环-2-酮。4-溴甲基-5-甲基-1,3-二氧戊环-2-酮是合成抗菌药伦氨苄西林盐酸的中间体。CDMDO主要用于青霉素、氨苄青霉素等抗生素类药物的修饰，以合成具有光学活性的手性药物，较大程度地提高药效，减轻药物的副作用。

手性乙偶姻的生产方法主要分为两类：化学合成法与生物合成法。化学法合成法过程繁琐，最后还需要进行复杂的手性拆分，存在成本高、收率低、光学纯度低、高能耗、高污染的问题，且原料来源于不可再生的化石资源——石油，原料来源受到限制。

生物合成法是一种十分具有发展前景的环境友好合成方法，近年来受到了越来越多的关注。然而，天然微生物发酵产生的一般都是S-乙偶姻和R-乙偶姻的旋光异构体混合物，发酵产物手性拆分工艺繁琐，成本高昂。因此，人们尝试构建重组大肠杆菌生物催化剂来合成S-乙偶姻。休止细胞催化是指利用完整的休止细胞作为生物催化剂进行生物转化，其本质是利用细胞内的酶进行催化，综合了发酵法和酶法催化这两种技术的优点，克服了发酵法存在的诸多缺点。研究者通过构建重组大肠杆菌异源表达来自于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的(R,R)-2,3-丁二醇脱氢酶和来自于短乳杆菌(Lactobacillus brevis)的NADH氧化酶，获得能够催化手性纯meso-2,3-丁二醇成为S-乙偶姻的重组大肠杆菌休止细胞生物催化剂，产物光学纯度为96％【专利申请号:CN200910013902.8；PLoS ONE,2010,5:e8860】。但是，上述的休止细胞催化反应均需要使用工业难以制备的前体——手性纯meso-2,3-丁二醇。丁二酮价格远远低于手性纯meso-2,3-丁二醇，若能利用其为前体合成光学纯S-乙偶姻，则能有效降低S-乙偶姻的生产成本，从而更具有商业化应用前景。

研究者尝试使用纯酶催化还原丁二酮的方法制备手性纯S-乙偶姻，他们通过构建重组大肠杆菌分别表达氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)DSM2003的丁二酮还原酶和B.subtilis168的葡萄糖脱氢酶。这两株重组大肠杆菌经过诱导表达目的产物后，收集细胞进行破碎，然后通过酶分离纯化获得条带单一的丁二酮还原酶和葡萄糖脱氢酶。利用纯化的丁二酮还原酶偶联纯化的葡萄糖脱氢酶组成催化体系，在加入辅酶NADPH的条件下，可催化丁二酮产生手性纯S-乙偶姻【Bioresource Technol.,2013,137:111-115】。纯酶催化的方法具有产物分离纯化简便的优点，但需要破碎细胞和分离纯化酶，而且需要加入昂贵的辅酶NADPH，工艺繁琐，成本较高。