[发明专利]一种全细胞催化产乳果糖的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种全细胞催化产乳果糖的方法，属于食品生物技术领域。

背景技术

近年来，肥胖、糖尿病和心血管疾病人群呈现逐年增加和低龄化的趋势，使得低热量、具有更多功能特性的功能性甜味剂成为广大食品从业者研发和关注的焦点。世界上有70％的人具有乳糖不耐症，食用乳糖后会引起严重的胃肠道问题，每年世界上有几百万吨的乳糖因得不到进一步利用而被白白浪费同时引起环境污染，如何高效地利用乳糖成为急需解决的难题。而通过乳糖异构化得到的乳果糖以其优越的功能特性正成为广大消费者和食品从业者关注的新热点。

乳果糖(4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-果糖)为乳糖异构化产物，是一种人工合成的且不能被人体消化吸收的功能性低聚糖。1957年奥地利学者Petuely发现，通过添加乳果糖，可使人工哺喂的婴儿肠道菌群与母乳哺喂的婴儿相接近，首次证实了乳果糖是一种双歧杆菌增殖因子。在日本，乳果糖被认定为“特定保健用食品”添加剂而得以广泛使用。目前在世界范围内，乳果糖被广泛应用于医药、保健、食品添加剂以及动物饲料等行业。在临床医药行业，乳果糖主要用于治疗肝性脑病、便秘、内毒素以及降血糖、降胆固醇等，在食品行业中被广泛添加到婴幼儿奶粉、软饮料以及保健品中，主要是发挥其双歧杆菌增殖因子的作用。

目前全球每年乳果糖的产量已超过60000吨，国内乳果糖生产企业仅有大连化工研究设计院、丹东康复制药有限公司等少数企业，产品为低纯度乳果糖糖浆，国内药用级高纯乳果糖几乎全部依赖进口。且国内工业化生产均依靠化学法，酶法生产乳果糖还未实现产业化。化学法生产乳果糖具有转化率高、可实现大规模生产等优点，但是化学异构化法的缺点也很突出，如反应副产物多、脱盐操作复杂、能耗高以及存在安全隐患问题等。为了克服化学异构法存在的各种弊端，生物酶法转化乳糖制备乳果糖因其制备的产物单一，天然无毒，符合广大消费者追求天然产品的消费心理而成为目前的研究热点。

目前用于生产乳果糖的酶主要有β-糖苷酶、β-半乳糖苷酶以及来源于Caldicellulosiruptor saccharolyticus的纤维二糖差向异构酶。其中β-糖苷酶以及β-半乳糖苷酶的转化率比较低(7.5-30％)，得其不适合乳果糖的工业化生产。使用纤维二糖差向异构酶的纯酶进行乳果糖的酶法生产时，在反应体系中需添加大量硼酸，硼酸是一种对人体有害的物质，脱除硼酸需要采用膜分离技术结合昂贵的脱硼树脂，这会增大乳果糖工业生产的成本，同时带来食品安全隐患。

如何有效避免上述问题而实现乳果糖的高效酶法生产必将成为食品工业从业者面临的新任务。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一株异源表达纤维二糖差向异构酶的基因工程菌，是以大肠杆菌为宿主、以pET-28a(+)为表达载体，表达核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的纤维二糖差向异构酶。

所述大肠杆菌优选E.coli BL21(DE3)。

本发明要解决的第二个技术问题是提供一种诱导所述基因工程菌表达纤维二糖差向异构酶的方法，是利用IPTG或乳糖诱导重组E.coli BL21(DE3)发酵产纤维二糖差向异构酶。

所述方法优选以构建好的产纤维二糖差向异构酶的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)作为生产菌株，经活化、扩大培养至对数期OD₆₀₀＝0.2-2.0时加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.05-1.2mM或者加入乳糖至终浓度为0.5-50g/L，15-45℃，150-250r/min摇床培养8-24h，离心收集菌体。

本发明要解决的第三个技术问题是提供一种利用所述基因工程菌全细胞催化生产乳果糖的方法，主要包括以下步骤：(1)以乳糖诱导培养重组E.coli BL21(DE3)产纤维二糖差向异构酶；(2)收集培养得到的菌体通过乙醇透化、真空冷冻干燥处理作为细胞生物催化剂；(3)将细胞生物催化剂直接用于转化乳糖生产乳果糖。

所述步骤(2)优选将1L发酵液中离心收集到的菌体悬浮于1-100mL1-90％(v/v)的乙醇中，4-30℃下混匀5-120min进行透化处理，离心收集沉淀，经真空冷冻干燥得到的菌粉4℃条件下保存，菌粉作为细胞生物催化剂直接用于转化乳糖生产乳果糖。用乳糖诱导的全细胞透化后的酶活为300-400U/g。

所述透化处理时优选40％(v/v)乙醇。

所述步骤(3)优选以下步骤：