[发明专利]东北自然发酵酸菜中细菌多样性的DGGE分析方法

权利要求书

1.一种东北自然发酵酸菜中细菌多样性的DGGE分析方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：

（1）、选择酸菜样品，对样品进行预处理及菌体收集；

（2）、采用FastPrep结合CTAB法进行酸菜样品中微生物总DNA的快速提取；

（3）、以提取的微生物的总DNA为模板，采用16S rRNA基因V3区具有特异性的引物对.进行细菌16S rRNA的PCR扩增，将PCR反应的产物用琼脂糖凝胶电泳检测；

（4）、将PCR产物进行DGGE电泳分析；

（5）、电泳结束后对DGGE产物进行染色、扫描仪成像，得到DGGE 图谱，

在酸菜样品细菌DGGE 图谱上标记特异性条带，切胶回收；

（6）、回收的DNA条带需重新进行PCR扩增，然后对产物进行测序，将测得的序列结果在NCBI数据库进行Blast同源性对比分析，确定细菌的归属，即完成东北自然发酵酸菜中细菌多样性的DGGE分析方法。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤（1）中，样品为东北地区任意采集的自然酸菜样品，样品多点取自酸菜发酵汁液，混合后进行预处理。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤（1）中，对采集的酸菜样品进行预处理，收集菌体，具体步骤如下：在5mL酸菜发酵液样品中加入5mL PBS缓冲液，涡旋震荡30s，然后350rpm离心5min，收集上清，12000rpm离心5min后，弃上清，收集菌体，在沉淀中加入800μL TE缓冲液回溶，用于微生物总DNA的提取。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤（2）中，采用Fast Prep快速核酸提取仪结合CTAB法进行酸菜样品中微生物总DNA的快速提取，具体步骤如下：

①取预处理的步骤(1)中所述样品于2mL破碎管中，加入0.5g玻璃珠，置于Fast Prep核酸快速提取仪中，5.5m﹒s-1振荡45s，快速裂解样品;

②裂解：加入10%（质量/体积）SDS裂解液60μl，混匀后12000rpm离心10min，转移至1.5ml无菌离心管中，加入100μl 5mol/l的Nacl，80ul10mol/l的CTAB，65℃水浴20min;

③抽提：加入1ml的酚:氯仿:异戊醇=25:24:1,轻柔混匀，静置1min，12000rpm离心10min，取上清液再次进行抽提，加入1ml的氯仿:异戊醇=24:1,12000rpm离心10min，取上清液至无菌的1.5ml离心管中;

④沉淀：加500μl冰异丙醇，50μl 3mol/L的NaAC,颠倒，静置，混匀，-20℃放置30min，沉淀菌体，12000rpm离心10min;

⑤漂洗和风干：弃上清液，加500μl70%（积极比）无水乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心10min，弃上清，置于无菌操作台中用垂直风吹干，加30μlTE溶解沉淀，-20℃保存备用。