[发明专利]改良的黄灯笼辣椒叶片基因组DNA提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种改良的黄灯笼辣椒叶片基因组DNA提取方法，具体涉及利用正交设计优化黄灯笼辣椒基因组DNA提取中几个重要成分的浓度，旨在筛选出一种可获得高质量DNA分子的提取方法。

背景技术

海南黄灯笼椒(Capsicum chinense Jacquin)为茄科(Solanaceae)辣椒属(Capsicum)多年生草本植物，起源于南美亚马逊流域，又称黄辣椒、黄帝椒等，植物分类学上属于中国辣椒(Capsicum chinense)，是海南特有的地方珍稀辣椒品种，在海南有着悠久的栽培和食用历史，主要分布于海南岛东南、西南沿海地区，喜高温、强光，生长势强，枝叶茂盛，成熟果实黄色或金黄色，形状似灯笼，含有丰富的维生素C、胡萝卜素、矿物质、氨基酸及微量元素。另外，海南黄灯笼椒含有丰富的辣椒素类物质，具有极强的辣味，其鲜果辣度17万SHU左右，同时还含有其它芳香类物质，是加工辣椒酱和提取辣椒素的最佳原料之一，黄灯笼椒辣椒酱已成为海南知名的旅游产品，深受国内外消费者的欢迎，辣椒素的药理活性作用被世界各国广泛重视，能抑制胃酸分泌，刺激碱性粘液分泌，有助于预防和治疗胃溃疡；能加速能量和脂类的新陈代谢，减少体内脂肪积累；可阻止有关细胞的新陈代谢，降低癌症细胞的发生率。总之，海南黄灯笼椒具有极高的经济价值、营养价值和药用价值，在饮食和医药产品上应用广泛，是海南最具开发潜力的特色蔬菜作物。

基因组DNA提取是分子生物学研究的基础。常用的DNA提取方法主要有十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)法、十二烷基硫酸钠(SDS)法和高盐低pH法。SDS法操作简单，但所得产物含杂质较多；CTAB可破碎细胞壁和细胞膜，并能与核酸形成复合物，进而从富含多酚和多糖的植物组织中分离出高质量基因组DNA；高盐pH法提取DNA产率较低，且会残留较多的小分子物质。由于不同材料所含的物质成分及各种成分的含量差异较大，因此，对于不同植物基因组DNA提取应采取不同的方法。

高质量的DNA是进行遗传多样性分析、遗传连锁图谱构建和分子标记辅助选择的前提，是实验结果可靠性和重复性好的保证。模板质量将直接影响PCR扩增反应。酚类物质和多糖是影响植物基因组DNA提取的2个重要因素，常导致DNA分子降解，严重影响DNA纯度和产量。黄灯笼辣椒叶片富含糖类、蛋白质和酚类等物质，酚类物质容易发生氧化，与DNA结合形成黄色或黑褐色沉淀，难以溶解，DNA纯度较低，难以满足黄灯笼辣椒分子生物学研究需求。有效去除多糖、蛋白质和酚类物质等，是提取高质量DNA分子的关键。目前有效去除植物多糖、酚类物质的DNA提取方法主要有两种：一种是CsCl密度梯度离心法；一种是CTAB法，前者仪器设备要求较高，费时间，成本高；后者操作较为简单，适用于大多数植物DNA提取，应用日趋广泛。因此，需要采用改良的CTAB法优化黄灯笼辣椒基因组DNA的提取，快速、经济、安全、高效地提取黄灯笼辣椒基因组DNA分子。

聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作为清洁剂，具有吸附作用，能吸附多糖将其除去。二硫苏糖醇(DTT)是一种还原剂，有抗氧化作用，能有效的防止酚类氧化成醌，避免了DNA褐变的发生，但DTT的刺激性气味要小，毒性也比巯基乙醇低很多。用改良的CTAB法优化黄灯笼辣椒基因组DNA提取中几个重要成分(CTAB、PVP和DTT)的浓度，有助于筛选出可获得高质量DNA分子的提取方法，为进一步开展黄灯笼辣椒分子生物学研究奠定基础。

发明内容

本发明目的是针对黄灯笼辣椒叶片中富含酚类、糖类和蛋白的特点，利用正交设计优化黄灯笼辣椒基因组DNA提取中几个重要成分的浓度，筛选出一种可获得高质量DNA分子的提取方法，解决常规方法提取的DNA分子杂质较多、产率较低、易降解、易褐变、所用试剂毒性较大，如文献(向珣，宋小丽，施倩倩.DNA-AFLP分析用辣椒基因组DNA提取方法的优化.长江大学学报，2009，6(2)：48-51)，影响下一步分子生物学研究的难题。

本发明的技术方案如下：

改良的黄灯笼辣椒叶片基因组DNA提取方法，包括以下步骤：

(1)配制CTAB-3提取液，高温灭菌后，65℃预热；CTAB-3提取液为：0.1mol L^-1Tris pH7.5，0.05mol L^-1EDTApH8.0，0.7mol L^-1NaCl，2％CTAB，0.5％PVP，0.2％DDT；其中，百分比为质量百分比浓度；