[发明专利]源于土曲霉的活性增强的酰基转移酶突变体

说明书

技术领域

本公开内容涉及用于生物催化生成辛伐他汀的方法和材料。更具体的，本公开内容涉及比野生型酰基转移酶相比具有改进活性的非天然存在的酰基转移酶突变体、编码所述酰基转移酶突变体的多核苷酸、包含此类多核苷酸的宿主细胞、所述酰基转移酶突变体的生产方法及使用所述酰基转移酶突变体生物催化生成辛伐他汀的方法和材料。

发明背景

辛伐他汀是Merck公司研制的降血脂药，商品名Zocor，辛伐他汀(simvastatin)是洛伐他汀的半合成衍生物，而洛伐他汀是分离自土曲霉(Aspergillus terreus)发酵液的天然产物。辛伐他汀的药理作用是作为竞争性抑制剂抑制肝脏细胞内羟甲戊二酰辅酶 A 还原酶(HMG-CoA reductase)活力，限制 HMG-CoA 向甲基二羟戊酸的转化，从而减少内源总胆固醇的生物合成总量。与相同剂量的洛伐他汀(lovastatin)、普伐他汀(pravastatin)和氟伐他汀(fluvastatin)等其他HMG-CoA还原酶抑制剂相比，辛伐他汀可以更有效地降低血清中的总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇。

1984 年，Hoffman 等发表了以洛伐他汀为起始原料，化学合成辛伐他汀的侧链水解路线，但该路线的副产物较多，因而给产物分离纯化带来不利影响。

1986年，Sleiteinger等发表了洛伐他汀的直接甲基化路线，该路线经 Verhoeven (1989 年)、Kumar (1998 年)等修改提高，成为目前生产上使用最多的工艺，但直接甲基化路线需要多种昂贵及危险的化学试剂。

由于化学法合成过程条件苛刻，副反应多，产品分离纯化难度大，并因此造成目前制备辛伐他汀的成本较高。因此，极需一种能低成本高效率制备辛伐他汀和相关化合物的方法。

Xie 等已从Aspergillus. terreus 菌克隆获得酰基转移酶的编码基因并在E.coli中高表达。利用所得工程菌可以直接催化莫那克林 J 到辛伐他汀的转化，转化率达到 99%。印度 Ranganathan将不同来源的聚酮合成酶(PKS)功能域 DNA 序列组合成多种不同的洛伐他汀二酮合成酶基因，并在土曲霉(Aspergillus terreus)中表达，直接发酵产生辛伐他汀。

Xie等用丙氨酸残基或极性天然氨基酸替换Cys40和Cys60，显著提高酰基转移酶的可溶性表达。并且进一步实验证明这些突变具有可加性，其中 C40A/C60N双突变体表现出溶解度和全细胞生物催化活性近 50％的增长。

以上主要通过过表达酰基转移酶的大肠杆菌 (E.coli)基因工程菌株作为全细胞生物催化剂，在单个发酵过程中合成制备量的辛伐他汀。以上研究证明酰基转移酶可用于辛伐他汀等重要的降低胆固醇药物的生物合成，是一种非常有吸引力的酶。然而，在使用分离的酰基转移酶进行的随后的实验中，稳定性和反应速率被证实是有问题的。具体来说，发现酰基转移酶在高蛋白浓度时容易沉淀，而在较低浓度时缓慢沉淀。此外，发现产物辛伐他汀会竞争酰基转移酶，显著地阻碍酰化的总净速率。

酰基转移酶在大肠杆菌中过表达时也高度倾向于错误折叠和聚集，使得对于工业规模生产来说即使是全细胞生物催化系统也不太理想。

朱丽平等在大肠杆菌BL21(DE3)中表达酰基转移酶，通过优化发酵条件，发酵培养基，接种量，诱导物浓度及诱导时间等，最后的酰基转移酶表达水平仅为100mg/L，辛伐他汀产量也仅为1.2g/L，远远达不到工业规模生产的要求。

发明内容