[发明专利]诱导间充质干细胞向肾小球系膜细胞分化的培养液及方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用新型细胞生长因子人血小板衍生生长因子-BB与全反式维甲酸联合高效诱导间充质干细胞分化为肾小球系膜细胞的培养液及诱导方法。

背景技术

各种肾脏疾病渐进发展成为终末期肾功能衰竭时通常只能借助于肾脏替代性手段进行治疗，主要是透析和肾脏移植两种治疗方法。但这两种治疗手段均存在难于克服的障碍和不足。其中透析仅限于滤过功能的替代，不具有正常肾脏的代谢、分泌及维持内环境稳态等一系列重要功能，肾脏移植虽然相对于透析具有更好的治疗效果，却也同样面临免疫排斥、供体短缺等问题，需要寻找新的功能性肾小球系膜细胞移植物。间充质干细胞是一种具有多向分化潜能的细胞，它能够定向诱导为成骨细胞、神经细胞、肾脏细胞等多种功能性细胞。间充质细胞存在于人体多种组织中，包括骨髓、脐带、胎盘、脂肪等组织，具有来源广泛、易于采集、无伦理问题等优势，可规模化诱导分化为胰岛样细胞，为临床治疗肾功能衰竭提供新的技术方案。间充质干细胞能够通过分化成多种类型的肾实质细胞(包括肾小球系膜细胞、肾小球足细胞、肾小管上皮细胞和血管内皮细胞)，参与肾脏损伤后的细胞再生与结构重建以及功能的恢复。

人血小板衍生生长因子-BB通常被认为是一种多功能性的生长因子，在胚胎发育和成体稳态维持等方面均具有重要的作用。这种生长因子对细胞的效应，依细胞种类、作用浓度、微环境和细胞所处生理阶段的不同而不同，特别是对间充质干细胞的增殖、迁移和分化等方面均发挥重要的作用。人血小板衍生生长因子-BB也与肾小球系膜细胞的发育和增殖关系紧密，在生理或病理状态下体内包括系膜细胞在内的几种肾脏细胞均会产生血小板衍生生长因子-BB，以调节这些间质细胞的分裂和趋化效应，构建完整成熟的肾小球结构。

本发明建立了一种新的诱导间充质干细胞向肾小球系膜细胞分化的方法，联合使用血小板衍生生长因子-BB和全反式维甲酸，同时辅以IV型胶原作为胞外基质，与目前的常用诱导方法相比，提高了诱导效率和诱导周期，所获得的诱导形成的肾小球系膜前体细胞具有较强的生物活性，有助于更好的应用于临床移植，克服了现有诱导剂及诱导方法中诱导周期长、效率低、功能差等缺点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种诱导间充质干细胞向肾小球系膜细胞分化的培养液及诱导方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种诱导间充质干细胞向功能性肾小球系膜前体细胞分化的诱导培养液，包括人血小板衍生生长因子-BB、全反式维甲酸、IV型胶原和基础培养基。

所述诱导培养基中，人血小板衍生生长因子-BB的浓度为200 ng/ml，全反式维甲酸的浓度为1 μmol/L。

所述IV型胶原是以5μg/cm²的浓度包被于细胞培养板表面。

    所述基础培养基为含有2%的马血清、5ng/ml的bFGF的低糖DMEM培养液。

一种诱导间充质干细胞向功能性肾小球系膜前体细胞分化的方法，包括以下步骤。

(1) 配制诱导培养液：以低糖DMEM 为基础培养基，添加2%的马血清、5ng/ml的bFGF和诱导剂人血小板衍生生长因子-BB、全反式维甲酸，混匀，4 度保存。

(2) 制备人间充质干细胞。

(3) IV型胶原包被培养板：按照每平方厘米培养板表面积5μg的IV型胶原的浓度包被24孔培养板。

(4) 取间充质干细胞，以5×10³/cm²的细胞密度接种于IV型胶原包被的24孔培养板中，添加0.5ml诱导培养液进行诱导培养。

(5) 每3天换液，诱导培养9天去除培养液，收集细胞并置于-20度保存。

本发明的有益效果是：利用人血小板衍生生长因子-BB和全反式维甲酸联合诱导间充质干细胞向分化，并通过辅以IV型胶原模拟胞外基质环境，从而显著提高诱导分化效率，减少细胞因子使用种类，提高诱导细胞功能，降低临床应用风险。

 

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1A 是诱导培养的人骨髓间充质干细胞的细胞形态（40×），其中（1）为对照组，（2）为诱导组。

图1B 是诱导培养的人骨髓间充质干细胞的生长曲线。

图2 是通过免疫荧光技术分析诱导分化后细胞特异性蛋白desmin、α-smooth muscle actin和vimentin的表达。

图3是分化后的细胞对血管紧缩素Ⅱ处理的收缩反应。

具体实施方式