[发明专利]微生物发酵制备内切型壳聚糖酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物发酵和酶工程技术领域，具体地说，是一种微生物发酵制备内切型壳聚糖酶的方法。

背景技术

壳寡糖是指聚合度为2～10的聚氨基葡萄糖，相比其前体物质甲壳质和壳聚糖，除了具有共同的良好的生物相容性外，还具备下述优越特性：水溶性好、易被机体吸收利用及具有抑菌、抗肿瘤生理活性等。因此，壳寡糖在医药、食品、农业、环境及水处理等各领域有着广阔的应用前景。目前，应用壳聚糖制备壳寡糖主要有化学降解法和酶降解法，其中，生物酶法因具备专一性强、反应条件温和、过程易控制及环境污染少等特点，被本领域内的技术人员认为拥有更好的开发潜力。

壳聚糖酶（Chitosanase，EC3.2.1.132）能在温和条件下催化壳聚糖分子中β-1,4-糖苷键的水解，为酶法制备壳寡糖的最主要的限制因素。壳聚糖酶主要来源于真菌、细菌等微生物，所得的壳聚糖酶性质因其来源而不尽相同。对已获得的壳聚糖酶生产菌株进行深入的酶学研究，结果表明，这些微生物在受到诱导时，同时表达两种或多种内切型和/或外切型壳聚糖酶。内切型壳聚糖酶彻底分解壳聚糖后的产物主要为聚合度是2～4的壳低聚糖，而外切型壳聚糖酶的酶解产物则为壳单糖，即聚合度为1。目前本领域内所指的壳寡糖主要是指聚合度为2～10的壳低聚糖，由于外切型和内切型壳聚糖酶的伴随存在，使得生产聚合度为2～10的壳寡糖成为一个难以解决的问题。

魏福卫等（详见：壳聚糖酶高产菌的筛选、鉴定与发酵产酶初探，上海海洋大学学报，2011年3月）筛出一株壳聚糖酶高产菌株，命名为浅玫瑰色链霉菌Streptomyces roseolus DH，基本发酵条件经优化后，发酵液中壳聚糖酶活力达到6.1U/mL。基本发酵条件为：按2%（V/V）的接种量接入发酵培养基进行摇瓶发酵，发酵温度30℃，转速150r/min，装液量100mL/250mL，摇床震荡培养60h。但是关于本发明的发酵方法，目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种微生物发酵制备内切型壳聚糖酶的方法，所得发酵液中壳聚糖酶的酶活力达35U/mL。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种微生物发酵制备内切型壳聚糖酶的方法，所述的微生物是浅玫瑰色链霉菌Streptomyces roseolus DH。本发明所用菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号是CGMCC No.7742，保藏日是2013年6月18日，分类命名为Streptomyces roseolus。所述的发酵方法包括以下步骤：

（1）菌种活化：将保存的浅玫瑰色链霉菌Streptomyces roseolus DH接种于以胶体壳聚糖为唯一碳源的平板培养基，在30℃培养箱内倒置培养2～4天以活化菌株；所述的平板培养基配方为：(NH₄)₂SO₄ 0.51～1.0g，K₂HPO₄ 0.21～0.5g，氯化钠0.51～1.0g，硫酸镁0.01～0.2g，胶体壳聚糖1.01～1.2g，琼脂2.0g，加水至100mL，pH 7.0～7.2；

（2）种子液培养：挑取活化后的单菌落接种于液体种子培养基，在150r/min、30℃条件下进行摇床扩培菌株，培养至种子液的OD₆₀₀达到0.8～1.0，待用；所述的种子培养基配方为：蛋白胨0.51～1.0g，葡萄糖0.21～0.5g，氯化钠0.8～1.0g，K₂HPO₄ 0.02～1.0g，KH₂PO₄ 0.01～0.05g，酵母粉0.2～1.0g，硫酸镁0.02～0.08g，加水至100mL，自然pH；