[发明专利]微生物发酵制备内切型壳聚糖酶的方法

权利要求书

1.一种微生物发酵制备内切型壳聚糖酶的方法，所述的微生物是浅玫瑰色链霉菌Streptomyces roseolus DH，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：

    （1）菌种活化：将保存的浅玫瑰色链霉菌Streptomyces roseolus DH接种于以胶体壳聚糖为唯一碳源的平板培养基，在30℃培养箱内倒置培养2～4天以活化菌株；所述的平板培养基配方为：(NH₄)₂SO₄ 0.51～1.0g，K₂HPO₄ 0.21～0.5g，氯化钠0.51～1.0g，硫酸镁0.01～0.2g，胶体壳聚糖1.01～1.2g，琼脂2.0g，加水至100mL，pH 7.0～7.2；

（2）种子液培养：挑取活化后的单菌落接种于液体种子培养基，在150r/min、30℃条件下进行摇床扩培菌株，培养至种子液的OD₆₀₀达到0.8～1.0，待用；所述的种子培养基配方为：蛋白胨0.51～1.0g，葡萄糖0.21～0.5g，氯化钠0.8～1.0g，K₂HPO₄ 0.02～1.0g，KH₂PO₄ 0.01～0.05g，酵母粉0.2～1.0g，硫酸镁0.02～0.08g，加水至100mL，自然pH；

（3）发酵罐发酵产酶：发酵培养基按体积百分比40%～70%的装液量装入发酵罐中，将步骤（2）中的种子液按体积百分比2.1%～3%的接种量接入发酵培养基中，所述的发酵罐为平叶涡轮搅拌型发酵罐，发酵过程中保持罐压0.08～0.11MPa，搅拌速率为180～250r/min，控制空气流速1.2～2.0m³/h，发酵温度为30～31℃，发酵时间为50～60h；所述的发酵培养基配方为：胶体壳聚糖0.9～1.2g，氯化钠0.8～1.0g，K₂HPO₄ 0.05～0.15g，KH₂PO₄ 0.04～0.2g，硫酸镁0.03～0.1g，酵母提取物0.2～2.0g，蛋白胨0.2～2.0g，加水至100mL，用2mol/L盐酸调pH至7.0～7.2；

（4）粗酶液的收集：发酵完毕后收罐出料，离心发酵液后合并上清液，即获得内切型壳聚糖酶的粗酶液。

2.根据权利要求1所述的微生物发酵制备内切型壳聚糖酶的方法，其特征在于，所述的内切型壳聚糖酶水解壳聚糖的产物是聚合度为2～10的壳寡糖。

3.根据权利要求1所述的微生物发酵制备内切型壳聚糖酶的方法，其特征在于，所述的胶体壳聚糖的制备方法为：壳聚糖以1g/L的浓度溶解于0.1～2.0mol/L的HC1溶液，室温下搅拌过夜，加入等摩尔浓度的NaOH溶液，中和至pH 9.0～10.0，以300～400目纱绢过滤得絮状沉淀，并用水重复洗涤沉淀1～3次，直到pH为中性，最后用10000r/mim的速度匀浆处理沉淀8～15min，打匀后即得胶体壳聚糖。

4.根据权利要求1所述的微生物发酵制备内切型壳聚糖酶的方法，其特征在于，所述步骤（1）中的平板培养基配方为：(NH₄)₂SO₄ 0.6g，K₂HPO₄ 0.3g，氯化钠0.52g，硫酸镁0.1g，胶体壳聚糖1.1g，琼脂2.0g，加水至100mL，pH 7.0。

5.根据权利要求1所述的微生物发酵制备内切型壳聚糖酶的方法，其特征在于，所述步骤（2）中种子液的OD₆₀₀为0.9～1.0。

6.根据权利要求1所述的微生物发酵制备内切型壳聚糖酶的方法，其特征在于，所述步骤（2）中的种子培养基配方为：蛋白胨0.6g，葡萄糖0.3g，氯化钠0.8g，K₂HPO₄ 0.07g，KH₂PO₄ 0.03g，酵母粉0.5g，硫酸镁0.05g，加水至100mL，自然pH。

7.根据权利要求1所述的微生物发酵制备内切型壳聚糖酶的方法，其特征在于，所述步骤（3）中发酵罐的体积为10升，发酵培养基按体积百分比60%的装液量装入发酵罐。