[发明专利]一种基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法

说明书

技术领域

本发明属于基因芯片技术，特别设计基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法。

背景技术

早在上世纪70年代，Penn等人首次发现在哺乳动物DNA中存在5-羟甲基化胞嘧啶（5hmC）(Pennetal.,1972)。然而由于研究方法的落后，5hmC一直没有受到应有的重视。直到2009年，Kriaucionis和Tahiliani两位科学家证实小鼠的Purkinje细胞，颗粒神经元以及胚胎干细胞存在5hmC(Kriaucionis and Heintz,2009;Tahiliani et al.,2009)，在哺乳动物的其他组织中同样检测到大量5hmC的存在(Globisch et al.,2010)，人们才意识到5hmC对于调节机体生理生化的重要性研究。因此，5hmC已成为表观遗传学研究的热点。然而，如何调控基因组5hmC的含量以及如何高效检测基因组特定位点的5hmC状态，则对其调控的分子机制显得尤为重要。对于前者，新近发现TET蛋白家族使人们对5hmC有了更深入的了解，TET是一种能够催化5甲基胞嘧啶产生5羟甲基胞嘧啶的加氧酶。TET蛋白家族有3个成员，分别是Tet1，Tet2和Tet3。它们都含有一个序列保守的C-端催化结构域片(Ito et al.,2010;Tahiliani et al.,2009)，并具有2-氧化戊二酸和2价铁原子依赖型双加氧酶的典型特征(Aravind and Koonin,2001;Loenarz and Schofield,2009)。通过调控TET的表达来调节特定基因的5hmC含量，来实现5hmC参与信号通路调控的机制研究。而对于高效检测基因组特定位点的5hmC状态，目前只能检测有限的5hmC位点，或者检测结果存在假阳性，检测结果不准确以及检测成本高的限制。因此，很有必要在现有技术的基础之上，研究设计一种基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法。

发明内容

发明目的：本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种检测结果准确，高通量，高特异性，高灵敏度，成本低，操作简便易行的5-羟甲基化胞嘧啶的检测方法。

技术方案：为了实现以上目的，本发明所采取的技术方案为：

一种基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法，其包括以下步骤：

（1）首先将滚环扩增引物固定到芯片上成微阵列；

（2）然后用β-葡萄糖基转移酶处理待检测基因组DNA，将待检测基因组DNA中所有5-羟甲基化胞嘧啶进行糖基化修饰，再用亚硫酸钠处理糖基化修饰后的DNA，DNA中所有未发生羟甲基化胞嘧啶C反转成尿嘧啶U，而糖基化修饰5-羟甲基化胞嘧啶不被反转；

然后将检测不同C位点的开环探针I和开环探针II放置于同一反应管中，并进行杂交连接，若特定C位点发生羟甲基化，则开环探针I能连接成环（从而可用于检测5-羟甲基化胞嘧啶）；若未发生羟甲基化，则开环探针II能连接成环（可用于检测尿嘧啶U）；

（3）再将步骤（2）连接成环后产物同步骤（1）芯片杂交，固定芯片的滚环扩增引物以步骤（2）中的连接成环后产物为模板进行滚环扩增；然后采用不同荧光检测探针同芯片杂交，根据芯片不同矩阵点荧光的类型和强弱，检测出待测基因组DNA中不同C位点是否发生了羟甲基化及其频率大小，从而实现快速检测待测基因组DNA中5-羟甲基化胞嘧啶。

作为优选方案，以上所述的基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法，其中步骤（1）所述的滚环扩增引物长23bp，其包括5’端8个T和3’端15bp，近3’端15bp与开环探针I或开环探针II的5’端的15bp序列互补。

作为优选方案，以上所述的基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法，所述芯片是普通玻璃片或是微球，其表面是聚丙烯酰胺修饰；被固定的扩增引物5’端为丙烯酰胺基团修饰。

作为优选方案，以上所述的基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法，步骤（2）所述的开环探针I和开环探针II均为合成的寡核苷酸，开环探针I和开环探针II均由4部分组成，分别包括30bp的C位点检测部分、17bp的通用荧光检测探针杂交部分、15bp的通用扩增引物杂交部分以及5bp的连接序列部分；其中开环探针I和开环探针II的C位点检测部分和通用荧光检测探针杂交部分不同，而通用扩增引物杂交部分和连接序列部分的序列长度和组成均相同。以上所述的开环探针I和开环探针II的C位点检测部分，其中仅对应C位点互补碱基开环探针I为A，而开环探针II为G，其余序列相同。