[发明专利]一种萤火虫荧光素酶及其编码基因及获取方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子酶学与生物技术，更具体涉及一种高热稳定性高活性萤火虫荧光素酶的编码基因以及该酶的获取方法。

背景技术

在镁离子,ATP,分子氧的存在下萤火虫荧光素酶催化底物虫荧光素的氧化同时发出荧光。这个反应具有极高的效率。目前萤火虫荧光素酶已经作为研究领域的新工具出现在市场上，它具有非放射性、反应灵敏、结果准确、应用范围广、操作简单、无毒副作用等多种优点，因此非常适合应用于分子生物学、生命科学、医学、刑侦、药理学、微生物检测等各个领域。例如在医疗中，它可被用于癌症转移的研究和检测抗癌疗法的疗效，在刑侦上可以用来检测血迹，而其中具有最广阔市场前景的便是荧光素酶在环境微生物检测方面上的运用。在过去的十年里，ATP荧光快速检测法已经变成一种国际测定物体表面清洁水平的标准方法。

虫荧光素酶可以从萤火虫体内直接获取。随着分子生物学技术的发展，近年来通过基因工程技术制备虫荧光素酶的方法也已经成熟。1985年，De Wet等首次克隆了北美萤火虫(P.Pyralis)荧光素酶的基因，并成功利用大肠杆菌表达制备了虫荧光素酶。国内方面，林金明等人于2008年获得了含有虫荧光素酶基因表达载体的重组细胞，培养该细胞，成功获得具有生物活性的虫荧光素酶，实现了虫荧光素酶生产的国产化。

然而，野生型和重组型的荧光素酶很不稳定，当它们暴露于30℃，尤其是35℃以上时会迅速失去活性。这样的热稳定性不能满足该酶在高温下的使用及保存，或通过加热提高反应速度。目前有很多针对提高萤火虫荧光素酶(luciferase)稳定性方面的改造。例如，Peter J Whiter等人在北美萤火虫(P.Pyralis)荧光素酶引入的两个突变点E354K，A215L已经被证明有效的提高了虫荧光素酶的热稳定性。另外，2010年Mehdi Imani等人在北美萤火虫荧光素酶(luciferase)中引入突变点A296C/A326C,同样成功提高了其热稳定性并降低了其对PH的敏感度。尽管在提高虫荧光素酶的稳定性方面取得一定进展，但目前该方面研究主要集中于西方国家。随着萤火虫荧光素酶在国内应用的普遍，非常有必要生产具有自主知识产权的高稳定性虫荧光素酶。

发明内容

本发明首先所要解决的技术问题是克服原有北美萤火虫荧光素酶热稳定性差，尚不能满足高温下应用的缺陷，对原有北美萤火虫荧光素酶进行突变，得到热稳定性显著提高的突变酶，提高其应用价值。

本发明的另一个技术问题是提供编码上述北美萤火虫荧光素酶突变体的编码基因。

本发明还有一个技术问题是提供上述北美萤火虫荧光素酶突变体的制备方法。该方法是构建含有野生型萤火虫荧光素酶基因的重组表达载体，利用亲和层析的方法纯化该蛋白，该方法简单易行，操作简单，成本低廉。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种具有北美萤火虫荧光素酶活性的蛋白质,其氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

本发明的氨基酸序列获得方法，步骤如下：

（1）从PDB数据库中下载北美萤火虫荧光素酶的PDB格式的坐标文件1BA3，利用DeepView4.1软件对1BA3文件进行处理：补全缺失残基及原子，去除配体分子；

（2）利用Gromacs4.5.4对处理后文件进分子动力学模拟，计算蛋白质每个脯氨酸的RMSF（Root Mean Square Fluctuation）值；确定了具有最高灵活性的区域482-491aa；

（3）脯氨酸出现在I型，II型β转角的i+1位置氨基酸及II型β转角i位置氨基酸的概率最大；确定萤火虫荧光素酶结构中提高稳定性突变位点：H489P，即将野生型萤火虫荧光素酶氨基酸序列的第489位的组氨酸突变为脯氨酸。

编码中所述蛋白质的基因，DNA序列为SEQ ID NO.2。

本发明包括所述基因的重组载体与重组菌。

本发明所述的重组载体获取方法，通过将包含野生型Luc基因的载体进行定点突变得到，该突变是将野生型北美萤火虫荧光素酶(P.Pyralis luciferase)基因上的第489位的组氨酸密码子改变成脯氨酸的密码子。

重组载体获取方法步骤如下：

1）含有野生型萤火虫荧光素酶基因的重组载体的构建：