[发明专利]一种萤火虫荧光素酶及其编码基因及获取方法

权利要求书

1.一种具有北美萤火虫荧光素酶活性的蛋白质,其特征是氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

2.权利要求1中所述氨基酸序列获得方法，其特征是步骤如下：

1）从PDB数据库中下载北美萤火虫荧光素酶的PDB格式的坐标文件1BA3，利用DeepView4.1软件对1BA3文件进行处理：补全缺失残基及原子，去除配体分子；

2）利用Gromacs4.5.4对处理后文件进分子动力学模拟，计算蛋白质每个脯氨酸的RMSF（Root Mean Square Fluctuation）值；确定了具有最高灵活性的区域482-491aa；

3）脯氨酸出现在I型，II型β转角的i+1位置氨基酸及II型β转角i位置氨基酸的概率最大；确定萤火虫荧光素酶结构中提高稳定性突变位点：H489P，即将野生型萤火虫荧光素酶氨基酸序列的第489位的组氨酸突变为脯氨酸。

3.编码权利要求1中所述蛋白质的基因，其特征是DNA序列为SEQ ID NO.2。

4.含有权利要求3中所述基因的重组载体与重组菌。

5.权利要求4所述的重组载体获取方法，通过将包含野生型Luc基因的载体进行定点突变得到，该突变是将野生型北美萤火虫荧光素酶(P.Pyralis luciferase)基因上的第489位的组氨酸密码子改变成脯氨酸的密码子。

6.如权利要求5所述的获取方法，其步骤如下：

1）含有野生型萤火虫荧光素酶基因的重组载体的构建：

（1）以含有荧光素酶基因的质粒pGL2-control vector的核苷酸序列，结合质粒pET28a的多克隆位点与荧光素酶（Luc）基因的限制性内切酶位点设计引物；引物中包含BamHⅠ和HindⅢ突变位点；

（2）以含有Luc基因的质粒pGL2-control vector为模板，进行PCR扩增；含有Luc基因的PCR扩增产物纯化后，用限制性内切酶BamHⅠ和HindIII进行双酶切，酶切产物与用同样酶切的载体pET28a用T4连接酶进行连接；连接产物转化进入大肠杆菌DH5α；

（3）在固体培养基上随机挑取几个单菌落接种至含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃震荡培养12h，提取质粒；利用BamHⅠ和HindIII进行双酶切验证；验证成功的克隆子进行测序验证；

2）快速定点突变方法引入突变位点：

（1）设计引物，引物中包含使Luc基因中489位组氨酸密码子改变为脯氨酸密码子的突变点；

（2）以上述步骤1）获取的含有野生型Luc基因的表达载体为模板，进行PCR扩增，扩增产物为突变型重组表达载体；该突变型重组表达载体内含有SEQ ID NO.2所示DNA序列。

7.权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌是将权利要求5中获得的重组载体转化进入大肠杆菌BL21（DE3）中得到。