[发明专利]分子标记辅助选育豇豆耐鼓粒品种的方法及其使用的PCR引物组

说明书

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，尤其涉及一种分子标记辅助选育豇豆耐鼓粒品种的方法。 

背景技术

长豇豆（Vigna unguiculata ssp. sesquipedalis (L.) Verd.）隶属蝶形花亚科（Fabaceae）菜豆族（Trib. Phasoleae DC.）豇豆属（Vigna Savi），是我国重要的夏季豆类蔬菜之一。由于主要食用部分为嫩荚，荚壁肥厚、种籽小、条荚均匀一致成为长豇豆商品嫩荚最重要的经济指标之一。然而长豇豆生产实际中常常遇到嫩荚发育过程中由于荚壁和种子的不均衡发育，特别是种子发育过早过快导致嫩荚在种子着生处凸起而其它区域凹陷的现象，称之为鼓粒（附图1）。嫩荚鼓粒严重影响嫩荚的外观品质，降低商品价值。豇豆嫩荚鼓粒的实质是豆荚中种子发育过早过快，导致种子占整个豆荚的比例过高。育种和生产实践表明，不同豇豆品种嫩荚鼓粒程度不同，选育和应用不易鼓粒的品种对豇豆生产具有重要意义。 

种子和果实的发育尤其是膨大和营养积累主要受光合产物的分配与利用所调控。蔗糖是植物光合产物在植物组织间运输和分配的主要形式，它作为养分和信号分子在植物的生长发育中发挥着至关重要的作用。研究表明，豆类作物嫩荚荚壁和种子对蔗糖的吸收和利用存在着显著的竞争关系，蔗糖在荚壁和种子间的分配、积累与代谢决定着种子在豆荚中所占的比例。蔗糖代谢与分配，包括韧皮部蔗糖卸载、蔗糖转化为己糖，以及己糖积累的过程受到蔗糖合成酶、蔗糖转化酶及蔗糖、己糖膜转运蛋白等众多因素的调控。蔗糖在植物体内必须先经蔗糖合成酶和转化酶分解为己糖后，才能用于植物的生长和发育。 

生理学研究发现易鼓粒豇豆品种在嫩荚发育早期比不易鼓粒品种具有更高的种皮细胞壁蔗糖转化酶（CWIN）活性和较高的胚细胞分裂活性。随后，由于易鼓粒品种种皮CWIN活性和胚己糖/蔗糖比值的快速下降导致其胚更早结束细胞分裂期和更早进入细胞膨大期，这是造成易鼓粒品种胚细胞具有更大体积的重要原因。因此，种皮CWIN在长豇豆嫩荚鼓粒中发挥着重要的作用，可以作为耐鼓粒育种的靶标。 

发明内容

针对豇豆耐鼓粒育种常规方法中单纯依靠在田间进行豆荚鼓粒性的目测或工具测量鉴定所存在的主观性强、易受环境影响、耗时费力、需要大量土地和人力资源等缺陷，本发明的一个目的是分子标记辅助选育豇豆耐鼓粒品种的PCR引物组，本发明的另外一个目的是提供采用上述引物组分子标记辅助选育豇豆耐鼓粒品种的方法。本发明的方法具有准确、快捷的特点。 

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案： 

分子标记辅助选育豇豆耐鼓粒品种的PCR引物组，该引物组的序列为上游引物：5'- TTTCCATGGTAAAATTTTTTACC -3'；下游引物：5'- CCATTCCAAGAACGATTTGGCT -3'。

为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案： 

分子标记辅助选育豇豆耐鼓粒品种的方法，其特征在于按以下步骤进行：

1）豇豆基因组DNA的提取：将各待检测豇豆样品用CTAB法提取基因组DNA后，分别保存，备用；

2）基因组DNA的PCR扩增：将豇豆各样品基因组DNA 20 ng，分别加入各PCR管中，并在各管中依次加入PCR引物组至终浓度各0.2 μM，dNTP 至终浓度0.25 mM，MgCl2 至终浓度2.0 mM，PCR缓冲液至终浓度为1倍，并加入Taq DNA聚合酶 1单位，最后加无菌重蒸水补足体积至20 μl后，在94℃预变性2 min，94℃变性30 sec，58℃退火30 sec，72℃延伸30sec，36个循环，72℃延伸5min下进行扩增，产物4℃保存；所述的引物组的序列为上游引物：5'- TTTCCATGGTAAAATTTTTTACC -3'；下游引物：5'- CCATTCCAAGAACGATTTGGCT -3'；

3）酶切产物的凝胶电泳分析：扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶，上进行电泳分离，然后银染进行显色，数码相机照相记录结果；所述的非变性聚丙烯酰胺凝胶为丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺=29：1；

4）豇豆样品耐鼓粒性的鉴定：依据PCR产物在凝胶上条带的模式，凡扩增产物为 180bp 片段的材料即为含豇豆耐鼓粒基因型的材料，凡不能获得PCR扩增产物的材料即为含豇豆不耐鼓粒基因型的材料；