[发明专利]一种蜂球囊菌发酵生产脂肪酶的培养基及方法

说明书

技术领域

   本发明涉及真菌的发酵培养基及工艺。更具体地，本发明涉及一种蜂球囊菌发酵生产脂肪酶的培养基及方法。

背景技术

蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis）是寄生于蜜蜂幼虫的一种真菌，可以引起蜜蜂白垩病。蜜蜂白垩病不仅使蜜蜂数量减少，而且蜂蜜产量也下降，近几年，有证据表明这种病的发生概率有增加的趋势。蜜蜂球囊菌也是影响我国养蜂业发展的潜在病害之一，对我国养蜂业的发展影响巨大。本发明就是希望从脂肪酶上分析蜜蜂球囊菌，提高脂肪酶的产量，对推动蜜蜂白垩病的防治研究具有指导性意义，为以后蜜蜂球囊菌的致病机理的研究奠定了基础。

脂肪酶（Lipase，EC3.1.1.3）是广泛存在于各类动物、植物和微生物中的一种酶,在脂质代谢中发挥重要的作用,具有显著的生理意义和生产应用的潜能。微生物来源的脂肪酶含量最为丰富。由于微生物种类多、繁殖快，易发生遗传变异，产生的脂肪酶具有比动植物脂肪酶作用更广的pH 值、反应温度范围以及底物专一性；而且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，适合于工业化大生产和样品提纯，因此，微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源，是生物技术和有机化学应用中使用最为广泛的酶类之一。

发明内容

     本发明的目的在于提供一种蜂球囊菌发酵生产脂肪酶的培养基及方法。

 本发明首先提供了一种蜂球囊菌发酵生产脂肪酶的培养基，培养基的原料含有乳化橄榄油5%（w/v），果糖 0.25--2%（w/v），酵母浸粉0.05-- 0.4%（w/v）， Na⁺  0.015-0.12 mol/L，VB₂ 0.005-0.04 %（w/v） ，pH7.4--7.7。

     本发明优选的一种蜂球囊菌发酵生产脂肪酶的培养基含有乳化橄榄油5%（w/v），果糖 2%（w/v），酵母浸粉 0.4%（w/v）， NaCl 0.015mol/L，VB₂  0.02 %（w/v） ，pH7.4。

其次，本发明还提供了一种蜂球囊菌发酵产脂肪酶的方法，所述方法包含以下步骤：

（a）将蜂球囊菌(郑志阳，李江红，梁勤，陈大福. 蜜蜂球囊菌分泌多种胞外酶侵染蜜蜂幼虫. 福建农林大学学报，2011,40(3), 9月30日)接种于种子培养基，制得发酵种子液；

（b）将步骤（a）中制得的发酵种子液接种于上述发酵生产脂肪酶的培养基中，250mL的三角瓶装液量为75mL，接种量5%，于25℃，转速120 r/min下培养。

所述种子培养基PDA的原料含有：按培养基重量计，马铃薯20%，蔗糖2%。

采用本发明优化后的培养基，菌龄3d，发酵周期96h，发酵产生结果蜂球囊菌产脂肪酶为14U/mL以上。

本发明的发酵方法有发酵周期短；条件温和，易于控制；提供的用于蜂球囊菌发酵生产脂肪酶的培养基，具有脂肪酶产率高，脂肪酶活力高，脂肪酶活性稳定以及重复性好等优点。

附图说明

图1为对硝基苯酚标准曲线。

具体实施方式

本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。

实施例1

单因素实验确定培养基最优成分

（1）种子培养基配制：马铃薯去皮，切块，称取200g，沸水煮30min， 6层纱布过滤，称取20g葡萄糖，加蒸馏水定容至1000mL，pH自然。高压灭菌121℃,20min。

（2）发酵种子液的制备：将蜂球囊菌接种于马铃薯琼脂培养基上，于30℃下培养3d，待其产孢子，即活化；将活化后的菌株用接种针将蜂球囊菌菌块（0.5×0.5cm）接种至种子培养基，25℃，转速120 r/min下培养48h即为发酵种子液。

（3）酶液的制备：取步骤（2）中的发酵种子液接种发酵培养基，25℃，转速120 r/min下培养72h，所得发酵液在4℃下， 8000 r/min离心，10min，得上清液即为粗酶液，4℃保存，待用。

  （4）脂肪酶酶活测定：酶活测定方法采用对硝基苯酚法。酶活定义为：在pH 8.0、50 ℃条下，每分钟水解p-NPP释放1 μmol对硝基苯酚（p-nitrophenol）所需的酶量为1个脂肪酶活力单位（U）。