[发明专利]一种产胆盐水解酶干酪乳杆菌KL1活菌制剂的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及产胆盐水解酶干酪乳杆菌KL1活菌制剂的制备方法，适用于家禽畜牧业中饲用功能性活菌制剂等微生态制剂的生产。

背景技术

本发明涉及的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)KL1是从开菲尔粒中分离纯化出来的一种具有降低胆固醇作用的乳酸菌。

“藏灵菇”(Tibetan Kefir，TK)又称开菲尔粒，19世纪被人类发现。开菲尔粒起源于俄罗斯北高加索地区，当地牧民将牛乳或山羊乳注入羊皮口袋经自然发酵生产酸乳酒，其残留物再补加牛乳或山羊乳继续发酵，经长期发酵后在皮口袋中形成不规则颗粒状物体，即为开菲尔粒。此后人们便直接将开菲尔粒添加到牛乳中，使之发酵成具有爽快酸味和起泡性的保健饮料，即为开菲尔。开菲尔具有多种保健功效。开菲尔中的活菌对志贺氏菌、沙门氏菌等病原菌的生长有强烈抑制作用；其中的酵母菌对结核杆菌、大肠杆菌有较强抗菌活性。故开菲尔对肠道疾病、肺结核有很好疗效。此外，开菲尔中的乳酸菌产生的代谢产物，如胞外多糖、胆盐水解酶等能有效预防肿瘤和高血脂症的发生。

在藏灵菇的黏多糖基质中微生物菌相主要以乳酸菌、酵母菌及少量醋酸菌为基础的小生态系。本发明所用干酪乳杆菌KL1是从藏灵菇中分离纯化出来的一种益生乳酸菌，可在生长代谢过程中产生大量高活力的胆盐水解酶，经过体外牛津杯试验和动物实验证明有降低机体血清总胆固醇含量的功效。其降低胆固醇机理是缘于干酪乳杆菌KL1代谢产生的胆盐水解酶(Bile Salt Hydrolase，BSH)。BSH是肠道中的双歧杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属中的多种乳酸细菌在生长过程中产生的代谢产物。大量实验证明，胆盐水解酶能在肝肠循环中将结合胆盐分解，产生氨基酸与溶解度较低的游离胆盐。后者能与胆固醇结合形成沉淀复合物而排出体外，从而降低血清总胆固醇的含量。

早在1963年人们就证实摄取含有某种乳杆菌或双歧杆菌发酵的酸奶具有降低血清胆固醇含量的功效。迄今为止，国内外学者对乳酸菌降胆固醇作用机理的研究尚存在不同观点，主要集中于以下三点：(1)乳酸菌菌体细胞直接吸收同化胆固醇；(2)乳酸菌的胆盐水解酶活性使结合态胆盐降解为游离态胆盐，后者溶解度下降与胆固醇发生共同沉淀作用；(3)其他理论，如吸收同化与共沉淀联合作用。

目前，国内申请各种活菌制剂制备方法的专利较多，如江苏省微生物研究所有限责任公司唐宝英和朱晓慧申请的“酪酸菌活菌制剂及其制备方法”(CN101032527)是由酪酸菌制备的人兽两用活菌制剂；上海信谊药业有限公司陈彬华和姚义强申请的“双歧三联活菌制剂及制备方法”(CN98110623.4)是由两歧双歧杆菌、嗜酸乳酸杆菌和粪链球菌冷冻干燥活菌粉作为活性成份与保护剂组成的；上海环伟生物科技有限公司张琴和陈建吕申请的“一种复合微生物活菌制剂及其制备方法和应用”(ZL200810034746)是利用片球菌、酵母菌和芽孢杆菌分别液体扩大培养，然后按所需比例混合，经固态发酵、干燥、粉碎制得的一种复合微生物活菌制剂。但关于利用分离筛选自藏灵菇中的产胆盐水解酶的干酪乳杆菌KL1制备活菌制剂，利用自动发酵罐高密度发酵，以及利用马铃薯粉浆保存生物制剂中活菌的方法尚未见国内外相关文献报道和专利报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用产胆盐水解酶的干酪乳杆菌KL1菌种制备活菌制剂的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

所述方法中，干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)KL1分离筛选自吉林、呼和浩特市普通家庭的藏灵菇(又称开菲尔粒)，并已于2006年9月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为：CGMCC No.1809(菌株KL1)。在含有碳酸钙和纳他霉素的MRS选择性培养基上，干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)KL1菌株的菌落大小2～3mm，表面粗糙如雪花状，边缘不规则，无光泽，扁平，灰白色，半透明，菌落有较高黏性；个体形态呈杆状，长短不等，短链状排列，有时菌体呈球形，G⁺无芽孢杆菌。

所述方法中，将脱脂乳试管保种的干酪乳杆菌KL1菌株以新鲜灭菌脱脂乳于37℃培养12h，至脱脂乳凝固，如此活化2～3代后，冷藏备用。

所述方法中，在上述试验的基础上，将活化好的菌液以2％(V/V，体积分数)的接种量移种至改良MRS培养基中，于37℃培养12h，得到扩大培养液。