[发明专利]高产蛋白酶枯草芽孢杆菌的筛选方法

说明书

 

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种菌株筛选方法。

 

背景技术

蛋白酶是水解蛋白质肽链的总称，包括酸性(pH 2．5～3)、中性(pH 7左右)和碱性(pH 8左右)3种。规模化养殖畜禽水产动物，尤其是养殖幼年动物，因其消化器官分泌的酶系和酶量(内源酶)不足，对饲料蛋白质消化能力较差，极易引起消化不良、腹泻与消瘦等疾病。因此，在饲料中添加酸性和中性蛋白酶，以提高动物对蛋白质的水解效率，促进动物对饲料蛋白质的吸收效率。但目前，国产饲用酸性蛋白酶比较少，主要是由于菌种酶活力低，生产成本高，因而其饲料营养研究有待于进一步深入展开。

枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用；枯草芽孢杆菌迅速消耗环境中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道PH值，间接抑制其它致病菌生长；刺激动物免疫器官的生长发育，激活T、B淋巴细胞，提高免疫球蛋白和抗体水平，增强细胞免疫和体液免疫功能，提高群体免疫力；枯草芽孢杆菌菌体自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体内的消化酶类一同发挥作用；能合成维生素B1、B2、B6、烟酸等多种B族维生素，提高动物体内干扰素和巨噬细胞的活性。

现有技术筛选蛋白酶枯草芽孢杆菌的方法普遍存在对菌株选择性低，筛选方法不科学，时间周期长，效率低的问题。

 

发明内容

本发明的目的在于，提供一种高产蛋白酶枯草芽孢杆菌的筛选方法，选择性强，效率高，所得菌株具备作为工业菌株的能力。

本发明提供的高产蛋白酶枯草芽孢杆菌的筛选方法，包括以下步骤：

一、菌株的处理与富集，取海水、污水适量接种至富集培养基中，富集培养基于35℃，170r/min振摇24h，制得富集菌液；

二、菌株的初步筛选，分别取适量所述富集菌液接种于脱脂奶粉平板培养基上，分别于35℃培养48h后观察；

三、菌株的复筛，取初筛后的菌株接种种子培养基，170r/min，35℃振荡培养24h，再将菌种液以体积分数1％接种于发酵培养基，170r/min，35℃振荡培养48h，12000r/min离心20min，收集上清液，采用改良Lowry法检测蛋白酶活力。

所述步骤一中的富集培养基由蛋白胨5g/L，酵母膏1g/L，磷酸高铁0.1g/L，琼脂20g/L，及海水配制而成，pH值为7.6；所述步骤二中脱脂奶粉平板培养基是在TS（50 mmol/L Tris-HCl、150 mmol/L NaCl，pH8.0）中加入1%琼脂糖和1%脱脂奶粉，0.06 MPa 高压灭菌10min，待温后倾注平板；所述步骤三中种子培养基由蛋白胨15g/L，酵母膏5g/L，酪素3g/L，氯化钠5g/L配制而成，pH为7.5；所述步骤三中发酵培养基由蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L配制而成，pH为7.5。

本发明提供的高产蛋白酶枯草芽孢杆菌的筛选方法，其有益效果在于，对高产蛋白酶菌株选择性强；筛选过程采用混合筛选，效率高；方法科学、时间周期短。

 

具体实施方式

下面结合一个实施例，对本发明提供的高产蛋白酶枯草芽孢杆菌的筛选方法进行详细的说明。

 

实施例

本实施例的高产蛋白酶枯草芽孢杆菌的筛选方法，包括以下步骤：

一、菌株的处理与富集，取海水、污水适量接种至富集培养基中，富集培养基于35℃，170r/min振摇24h，制得富集菌液；

二、菌株的初步筛选，分别取适量所述富集菌液接种于脱脂奶粉平板培养基上，分别于35℃培养48h后观察；

三、菌株的复筛，取初筛后的菌株接种种子培养基，170r/min，35℃振荡培养24h，再将菌种液以体积分数1％接种于发酵培养基，170r/min，35℃振荡培养48h，12000r/min离心20min，收集上清液，采用改良Lowry法检测蛋白酶活力。

所述步骤一中的富集培养基由蛋白胨5g/L，酵母膏1g/L，磷酸高铁0.1g/L，琼脂20g/L，及海水配制而成，pH值为7.6；所述步骤二中脱脂奶粉平板培养基是在TS（50 mmol/L Tris-HCl、150 mmol/L NaCl，pH8.0）中加入1%琼脂糖和1%脱脂奶粉，0.06 MPa 高压灭菌10min，待温后倾注平板；所述步骤三中种子培养基由蛋白胨15g/L，酵母膏5g/L，酪素3g/L，氯化钠5g/L配制而成，pH为7.5；所述步骤三中发酵培养基由蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L配制而成，pH为7.5。