[发明专利]一种绿僵菌发酵生产脂肪酶的培养基及方法

说明书

技术领域

本发明涉及真菌的发酵培养基及工艺。更具体地，本发明涉及一种绿僵菌(Metarhizium anisopliae)发酵生产脂肪酶的培养基及方法。 

背景技术

脂肪酶(Lipase，E.C.3.1.1.3，甘油三酯水解酶)，可在油水界面催化甘油三酯形成甘油二酯、甘油单酯或甘油及游离脂肪酸脂肪酶是一类分解和合成脂肪的酶。脂肪酶不仅可以催化酯水解反应还可以催化酯合成反应和转酯反应。微生物脂肪酶比动物脂肪酶酶解作用的pH和温度范围更宽，便于工业化生产获得高纯度酶制剂I21。脂酶在微生物界分布很广，据不完全统计，目前已有65个属的微生物能够产生脂肪酶 。随着对微生物脂肪酶研究的深入，已发现多种具有不同的酶学性质和底物特异性的微生物脂肪酶，其在水解、酯化、转酯及酯类手性合成等反应中都表现出较好的应用前景。 

就微生物脂肪酶而言，由于脂肪酶的结构及性质的多样性、酶的来源不足等问题，脂肪酶的研究进展及工业应用与蛋白酶、淀粉酶相比要慢得多，窄得多。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种绿僵菌发酵生产脂肪酶的培养基及方法，该培养基发酵生产的脂肪酶活力高，发酵方法的条件温和，易于控制，有利于工业化生产。 

本发明首先提供了一种绿僵菌发酵生产脂肪酶的培养基，所述培养基的原料含有橄榄油50.0 g／L，K₂ HPO₄ 1.0 g／L，CaCl₂ 0.1 g／L，NaCl 0.5 g／L，Mg₂SO₄·7H₂O 0.1 g／L，(NH4)₂SO₄ 1.0 g／L，葡萄糖10.0 g／L。 

其次，本发明还提供了一种绿僵菌发酵产脂肪酶的方法，所述方法包含以下步骤： 

（a）将绿僵菌接种种子培养基，制得发酵种子液；

（b）将步骤（a）中制得的发酵种子液按接种于权利要求1或2所述的培养基，100mL的三角瓶装液量为50mL，接种量10%，于25℃，转速150 r/min下培养。

所述种子培养基的原料含有：按培养基重量计，马铃薯20%，蔗糖2%，。 

  

本发明采用的绿僵菌为绿僵菌 MaYTTR-04(何学友等，金龟子绿僵菌MaYTTR-04菌株对松墨天牛成虫的致病力，昆虫学报, 2008年1月)。

采用本发明优化后的培养基，发酵周期72h，发酵产生结果绿僵菌MaYTTR-04产脂肪酶为30U/mL以上。 

本发明的发酵方法有发酵周期短；条件温和，易于控制；提供的用于绿僵菌发酵生产脂肪酶的培养基，具有脂肪酶活力高（30U/mL）等优点。 

附图说明

图1为对硝基苯酚标准曲线。 

具体实施方式

本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。 

实施例1

单因素实验确定培养基最优成分

（1）种子培养基配制：马铃薯200.0 g／L，蔗糖20.0 g／L，其余为水，分装于250mL的三角瓶，每个三角瓶含100mL。0.1MPa，灭菌20min。使用前可加入抗生素对培养基杀菌预处理。

（2）发酵种子的制作：将绿僵菌MaYTTR-04接种于马铃薯琼脂培养基上，于25℃下培养7d，待其产孢子，即活化；将活化后的菌株用接种针将孢子粉接种至种子培养基，25℃，转速150 r/min下培养48h，即为发酵液。 

（3）酶液的制备：取步骤（2）下的发酵液在4℃下， 5000 r/min离心，5min，得上清液即为粗酶液待用。按酶活性测定在波长410nm处的吸光值。换算成酶活单位U/mL。 

（4）脂肪酶酶活测定：在pH 8.0、50 ℃条件下，每min水解p-NPP释放1 μmol对硝基苯酚（p-nitrophenol）所需的酶量为1个脂肪酶活力单位（U）。 

方法：溶液A：150 mg p-NPP溶于50 mL异丙醇；溶液B：500 mL pH 8.0的Tris-HCl缓冲液中加入2.22 g Triton X-100和0.56 g阿拉伯胶。