[发明专利]一种兔出血症病毒“自杀性”DNA疫苗及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及动物病毒学与动物传染病学技术领域，特别涉及一种兔出血症病毒“自杀性”DNA疫苗及其构建方法。

背景技术

兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease，RHD)俗称“兔瘟”，是由兔出血症病毒(RHDV)引起的一种急性高致死性兔传染病。本病具有病死率高、死亡快，而且传播迅速等特点，对养兔业的健康发展造成了严重威胁，因而被国际兽疫局正式列为“国际动物保健编目”B类传染病，我国农业部也将之列为二类动物疫病。1984年初，刘胜江等在我国江苏无锡首次发现兔瘟以后，本病迅即蔓延到我国25省市、自治区，其后，世界各地如墨西哥及欧洲的许多国家也有类似兔瘟流行，给养兔业造成了巨大经济损失。

RHDV的衣壳蛋白为病毒的主要结构蛋白，称VP60。该蛋白是RHDV的主要结构蛋白，VP60构成的立体结构衣壳由180个完全相同的亚基组成，亚基之间相互作用然后形成具有三维构象的衣壳。该组装过程与各个亚基的N端序列有关，因为将该区段缺失后，VP60就再不能装配成空衣壳。RHDV在宿主细胞中完成一个复制周期后，由VP60组装的空衣壳将子代RNA包裹形成成熟的病毒粒，然后随着细胞的裂解释放出来，侵染其它的敏感细胞。大量研究结果证明RHDV的衣壳蛋白与病毒的致病性和免疫原性密切相关。国内外的学者使用不同的表达系统成功表达了VP60，用表达产物接种兔子可以诱导产生较强的免疫应答，并能对抗RHDV的攻击。

兔出血症病毒尚未建立体外组织细胞的培养方法，目前使用的疫苗主要为组织灭活苗。但随着家兔饲养成本的提高以及非免疫兔的减少，可用于制苗的肝组织日趋减少，使组织灭活苗的成本偏高，加之组织灭活苗可能导致散毒的缺点，近年来人们着眼于兔瘟新型疫苗的研究。

Berglund等(Berglund P，Smerdou C，Fleeton MN，et al.Enhancing immune responses usingsuicidal DNAvaccines.Nat Biotech，1998；16：562-565)于1998年率先提出了以甲病毒复制子为基础的“自杀性”DNA疫苗(suicidal DNAvaccine)的设想，即利用“自杀性”DNA疫苗的甲病毒进入细胞后能表达出甲病毒的非结构蛋白(nSPs)，在nSPs的作用下甲病毒基因组RNA进行高效复制，在此过程中产生大量的双链RNA(dsRNA)中间体，最终可使转染的细胞凋亡，基于甲病毒复制子的DNA疫苗可引起转染的细胞凋亡，也称“自杀性”DNA疫苗，它比传统DNA疫苗更安全，无整合到宿主染色体的潜在危险性。自杀性DNA疫苗可引起高水平的体液免疫和细胞免疫，且可打破免疫耐受。在甲病毒基因组高效复制同时，目的抗原在亚基因组启动子的调控下获得高效表达，从而可以较低的免疫剂量引起较强的免疫反应。

自杀性DNA疫苗的载体是以甲病毒复制子为基础的复制型DNA载体。病毒复制时结构基因拷贝数高达10⁵之多，因此可以利用亚基因组的启动子使外源基因获得高效表达。自杀性DNA疫苗由于其具有RNA复制子，大量复制可导致感染细胞的凋亡。该凋亡可能是复制型载体在表达外源基因的过程中产生双链RNA(dsRNA)复制中间体介入的结果。dsRNA能在细胞和体液免疫中起强大的辅助作用。后来，研究者将RNA复制子载体系统改造成以DNA为基础的、RNA聚合酶依赖的系统。这种载体携带了甲病毒复制酶基因和外源基因的重组质粒DNA，缺失了病毒结构蛋白基因。它通过将人巨细胞病毒(CMV)早期增强子/启动子序列插入到SP6启动子的上游或替换SP6启动子启动转录。同时，在多克隆位点下游插入强转录终止信号SV40晚期聚A信号序列，正常终止转录。该质粒DNA转染宿主细胞后，利用宿主RNA聚合酶n在细胞核内转录，合成甲病毒复制酶，再合成亚基因组RNA及大量外源蛋白，从而大大提高表达效率。因此，从自杀性DNA疫苗的构建上我们可以看出其具有RNA疫苗和DNA疫苗的优点，能自主复制、大量表达。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种兔出血症病毒“自杀性”DNA疫苗，以解决现有技术中现有的RHDV疫苗一般为弱毒苗或灭活苗，弱毒苗存在毒力返强的危险，而灭活苗往往需要多次免疫接种，而且效果不稳定，还经常导致免疫失败的技术问题。

本发明的第二目的在于提供一种兔出血症病毒“自杀性”DNA疫苗的构建方法。

本发明的技术方案如下：