[发明专利]一种兔出血症病毒“自杀性”DNA疫苗及其构建方法

权利要求书

1.一种兔出血症病毒“自杀性”DNA疫苗，其特征在于，该疫苗由RHDV-VP60基因和甲病毒复制子载体pSCA组成，其中，所述RHDV-VP60基因去掉了氨基端的31个氨基酸，其序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种兔出血症病毒“自杀性”DNA疫苗的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)以发病兔内脏组织为原料进行RHDV病毒总RNA的提取；同时设计如下两个特异性引物：

PSCA-VP60F：5’ATTGGATCC_(BamH I)GCCACCATGGGCGTGGTGGCCGC-3’，

PSCA-VP60R：5’AGACCCGGG_(SmaI)TCAGACATAAGAAAAGCC-3’；

2)以病毒总RNA为模板，使用反转录方法，以PSCA-VP60R为反转录引物合成PSCA-VP60的cDNA第一链，之后用特异性引物PSCA-VP60F和PSCA-VP60R进行PCR扩增，得到缺失氨基端31个氨基酸的VP60基因，并用试剂盒纯化回收；

3)将扩增的RHDV-VP60基因片段重组到甲病毒复制子载体pSCA真核表达质粒中，即得到兔出血症病毒“自杀性”DNA疫苗。

3.根据权利要求2所述的兔出血症病毒“自杀性”DNA疫苗的构建方法，其特征在于，所述步骤1)中，RHDV病毒总RNA的提取方法为：将RHDV病毒肌肉注射两月龄的新西兰大白兔，待新西兰大白兔死亡后，取其肝脏制备研磨液，按常规方法提取RHDV病毒总RNA。

4.根据权利要求2所述的兔出血症病毒“自杀性”DNA疫苗的构建方法，其特征在于，所述的反转录方法为：

用反转录试剂盒进行转录，反转录体系为：10×Buffer 2μL、RNA/引物变性溶液6μL、2.5mM dNTP Mixture 2μL、RNase Inhibitor 0.25μL、RTaseM-MLV 0.5μL，加灭菌蒸馏水9.25μL，使反转录体系体积为20μL，其中所述的RNA/引物变性溶液制备方法为：RNA模版5μL和特异性引物PSCA-VP60R 1μL在70℃水浴10min，冰上冷却2min；反转录过程为：将提取的RHDV-VP6042℃温浴1h后，70℃水浴15min，最后置冰上2min，得到的样品-20℃保存备用；

PCR扩增方法为：

反应体系为：2×Pfu PCR MasterMix 12.5μL、特异性引物PSCA-VP60F 0.5μL、特异性引物PSCA-VP60R 0.5μL、模版cDNA 2μL，加灭菌蒸馏水9.5μL，使反应体系体积为25μL；将上述反转录方法得到的样品瞬间离心混合，采用热盖进行PCR扩增反应，过程为：94℃预变性3min，然后94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环，72℃延伸10min后，10℃终止反应，并用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒纯化回收VP60cDNA片段。

5.根据权利要求4所述的兔出血症病毒“自杀性”DNA疫苗的构建方法，其特征在于，PCR扩增后获得的RHDV-VP60基因片段大小为1647bp。

6.根据权利要求2所述的兔出血症病毒“自杀性”DNA疫苗的构建方法，其特征在于，所述的步骤3)中，将扩增的VP60cDNA片段重组到甲病毒复制子载体pSCA真核表达质粒中的过程具体如下：

A、将扩增的RHDV-VP60基因片段和pSCA空载体用BamHI和SmaI进行双酶切，并用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒纯化回收；

B、将纯化回收的RHDV-VP60和pSCA空载体片段用T4DNA Ligase进行连接，连接体系为：10×Buffer 1μL、T4DNALigase 1μL、RHDV-VP606μL、pSCA 1μL，加灭菌蒸馏水1μL，使连接体系总体积为10μL，16℃水浴连接4h，之后将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，混匀，冰浴放置30min，42℃水浴中热激90S后迅速置冰上2min，然后涂布于氨苄抗性平板中，12h后挑取菌落并摇菌；

C、将得到的菌液利用AxyPrep DNA质粒抽提试剂盒抽提质粒，经酶切鉴定和经invitrogen公司测序显示，结果完全正确，从而成功构建成兔出血症“自杀性”DNA疫苗。

7.一种兔出血症病毒“自杀性”DNA疫苗用于制备预防兔病毒性出血症的药物中的用途。