[发明专利]窖泥细菌的鉴定方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及窖泥细菌的鉴定方法。

背景技术

窖泥微生态系统是由厌氧异养菌、甲烷菌、已酸菌、乳酸菌、硫酸盐还原菌和硝酸盐还原菌等多种微生物组成的共生群落系统。“百年老窖”其实质是窖泥中富集了大量以细菌为主的多种微生物菌群，经过长期不断的驯化及代谢产物的积累，产生了以已酸乙酯为主体的香气成分，为浓香型白酒带来了独特风味。窖泥质量的好坏直接对酒质起关键性作用，因此窖泥微生态系统中的微生物的选育及鉴定，对新窖老熟及进一步培养出优质窖泥，提高浓香型白酒的产量和质量提供技术支撑。

MicroStation快速微生物鉴定仪，可鉴定超过2000种好氧菌、厌氧菌和酵母菌，还可以进行霉菌的鉴定。该系统为美国FDA认可，适用于任何规模的实验室中，由于使用了方便的读数仪，非常节省劳动力。自Biolog全自动微生物鉴定仪问世以来，在微生物的鉴定上发挥了重大作用。该仪器的原理是利用固定在微孔板上的不同生化试验（检测待鉴定微生物对众多碳源的利用情况）对微生物提供表型概况并进行鉴定，Biolog鉴定系统MicroStation中的软件通过读取微孔板上所表现出的“表型指纹”被用来在种的水平上鉴定该微生物。

采用Biolog全自动微生物鉴定仪鉴定时，纯的培养物是鉴定的前提。在鉴定中最普遍的问题是技术人员可能没有意识到他们获得的并非纯的培养物，而是混合培养物。如果需要鉴定的微生物不纯，而该系统本身无提示性，且系统仍然把它当纯种微生物对待，根据碳源的利用情况来判别就会给出错误的鉴定结果。

窖泥中很多细菌能分泌粘液，具有粘性的表面，它们很容易和其它细菌紧紧的黏在一起，而窖泥中细菌种类繁多，通过一般的分离纯化得到纯的单菌株非常困难。白酒业是中国传统产业，酿酒窖池中窖泥细菌的分离鉴定对于揭秘中国传统白酒微量香味物质生成机理具有重大的现实意义。所以寻找一种快速、准确鉴定窖泥细菌的方法显得尤为重要。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种窖泥细菌的鉴定方法。

本发明的技术方案是窖泥细菌的鉴定方法，包括如下步骤：

1）获得待测菌株：无菌条件下，取窖泥于含有玻璃珠的灭菌水中，180rpm室温振荡30分钟，按10倍的梯度将菌液稀释到10^-6，取各稀释度的菌液接种到分离培养基中，37℃厌氧培养5～7天，得到单菌落；

2）验证待测菌株是否为纯化菌株：提取待测菌株的基因组DNA，扩增16s rDNA，将扩增结果测序，若测序结果没有重叠峰，即得到纯化的待测菌株，若测序结果有重叠峰，即进行二次纯化，得到纯的培养物；扩增引物的序列如SEQ ID No 1和SEQ ID No 2所示；

3）采用Biolog全自动微生物鉴定仪对纯的细菌菌株进行鉴定。

其中，步骤1）中分离培养基配方如下：基础培养基850mL/L，维生素溶液5mL/L，pH至6.0～6.5；121℃高压灭菌20min，冷却至65℃，加入2%无水乙醇。

其中，所述基础培养基配方如下：KH₂PO₄1.5g/L，(NH₄)₂SO₄0.5g/L，醋酸钠2.0g/L，酪蛋白氨基酸0.5g/L，蛋白胨0.5g/L，酵母膏0.5g/L，KCL 1.5g/L，FeCl₂·4H₂O 0.002g/L，CoCl₂·6H₂O 0.0002g/L，MnCl₂·4H₂O 0.00015g/L。

其中，所述维生素溶液配方如下：四氨基苯甲酸酯0.05g/L，烟酸0.1g/L，VB50.1g/L，VB60.15g/L，VB10.15g/L；滤膜过滤，-20℃保存。

在分离培养基中添加维生素溶液能给很多难于培养的厌氧微生物带来微量营养物质，使它们生长或是更好的生长，这样分离效果更好。

其中，步骤2）所述的二次纯化包括如下操作：无菌条件下，接种待纯化菌株于含有玻珠的灭菌水中，180rpm室温振荡30分钟，按10倍的梯度将菌液稀释到10^-6，取各稀释度的菌液接种到二次纯化培养基中，37℃厌氧培养5～7天，得到单菌落；所述二次纯化培养基为在分离培养基中添加20%的窖泥浸出液和5%的脱脂羊血得到。