[发明专利]窖泥细菌的鉴定方法

权利要求书

1.窖泥细菌的鉴定方法，其特征在于：包括如下步骤：

1）获得待测菌株：无菌条件下，取窖泥于含有玻璃珠的灭菌水中，180rpm室温振荡30分钟，按10倍的梯度将菌液稀释到10^-6，取各稀释度的菌液接种到分离培养基中，37℃厌氧培养5～7天，得到单菌落；

2）验证待测菌株是否为纯化菌株；提取待测菌株的基因组DNA，扩增16s rDNA，将扩增结果测序，若测序结果没有重叠峰，即得到纯化的待测菌株，若测序结果有重叠峰，即进行二次纯化，得到纯的培养物；扩增引物的序列如SEQ ID No 1和SEQ ID No 2所示；

3）采用Biolog全自动微生物鉴定仪对纯的细菌菌株进行鉴定。

2.根据权利要求1所述的窖泥细菌的鉴定方法，其特征在于：步骤1）中分离培养基配方如下：基础培养基850mL/L，维生素溶液5mL/L，pH至6.0～6.5；121℃高压灭菌20min，冷却至65℃，加入2%无水乙醇。

3.根据权利要求2所述的窖泥细菌的鉴定方法，其特征在于：所述基础培养基配方如下：KH₂PO₄1.5g/L，(NH₄)₂SO₄0.5g/L，醋酸钠2.0g/L，酪蛋白氨基酸0.5g/L，蛋白胨0.5g/L，酵母膏0.5g/L，KCL 1.5g/L，FeCl₂·4H₂O 0.002g/L，CoCl₂·6H₂O 0.0002g/L，MnCl₂·4H₂O0.00015g/L。

4.根据权利要求2或3所述的窖泥细菌的鉴定方法，其特征在于：所述维生素溶液的配方如下：四氨基苯甲酸酯0.05g/L，烟酸0.1g/L，VB50.1g/L，VB60.15g/L，VB10.15g/L；滤膜过滤，-20℃保存。

5.根据权利要求1所述的窖泥细菌的鉴定方法，其特征在于：步骤2）所述的二次纯化包括如下操作：无菌条件下，接种待纯化菌株于含有玻珠的灭菌水中，180rpm室温振荡30分钟，按10倍的梯度将菌液稀释到10^-6，取各稀释度的菌液接种到二次纯化培养基中，37℃厌氧培养5～7天，得到单菌落；所述二次纯化培养基为在分离培养基中添加20%的窖泥浸出液和3～5%的脱脂羊血得到。

6.根据权利要求5所述的窖泥细菌的鉴定方法，其特征在于：取20年以上窖龄的窖底泥，加水，小火煮30min，过滤，定容；定容比例为每50g窖底泥定容至1L。