[发明专利]酸性重组蛋白药物的纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质分离技术领域，具体而言，本发明涉及一种酸性重组蛋白药物的纯化方法。该方法主要用于大规模细胞培养生产的治疗用蛋白质药物的生产制备。

背景技术

近二十年来蛋白质药物发展迅速，目前有近百种重组蛋白药物上市，几千种处于研发状态。重组蛋白药物也称rDNA药物，重组蛋白药物虽然仅占全球处方药市场的7-8%左右，但是发展非常迅速，本世纪其发展更是进入黄金时节，2005年全球销售额即达到410亿美元，2009年仅美国市场蛋白质药物销售额已经达到了480亿美元，这其中抗体类药物占了约33%的份额。

重组蛋白质药物通常采用大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞等表达系统进行表达，其中动物细胞大规模培养生产蛋白质药物已成为当今生物制药领域的主流。临床许多蛋白药物，特别是治疗用药，需用较高剂量或长期用药，市场需求量较大，因此该类生物制药的大规模生产对工艺质量要求较高，必须符合美国FDA标准。抗体类或者Fc融合蛋白类药物通常采用一步Protein A亲和层析即可达到90%以上纯度，其他污染性杂质如脱落的Protein A、宿主细胞蛋白（HCP）、聚集体（D/A）以及DNA等主要通过离子交换等层析方法去除。其他重组蛋白药物的HCP、聚集体及DNA等杂质则往往需要更多的纯化步骤进行去除。

Protein A亲和层析在反复使用过程中会产生一定程度的脱落，残留在产品中的Protein A会引起不良免疫应答反应，其和抗体的复合物在体内可激活携带Fc的白细胞和补体系统的免疫应答，产生氧化和过敏反应，一般采用离子交换层析可以去除（CN 101120017A）。美国FDA建议产品中Protein A残留应低于10-12ppm。宿主细胞蛋白（HCP）是宿主细胞的蛋白成分，为异源蛋白，残留在产品中会引起机体的过敏反应，有研究显示，100ppm的HCP能够引起患者的免疫反应。

另外，聚集体在发酵、纯化以及制剂过程中因一些物理的和化学的因素而经常产生，比如培养的温度和时间、低pH值、剪切力以及表面吸附等。聚集体不但会使病人产生免疫反应，甚至会使人对药物产生免疫耐受性，从而大大降低了药物的药效（Subramanyam M. Immunogenicity of biotherapeutics-an overview. Journal of Immunotoxicology, 2006, 3, 151-156.）。此外，聚集体还会影响蛋白质药物的生物活性、稳定性以及保存期等。聚集体的去除主要通过层析过程来实现，层析技术比如离子交换层析（US Patent 2008/0058507 A1；US Patent 6,177,548 B1）和疏水层析（US Patent 2010/0069617 A1），如果聚集体含量高于10%时，单步IEC或HIC的去除能力非常有限，往往需要多个层析步骤才能有效降低聚集体（Y.Yigzaw, P.Hinckley, A.Hewig and G.Vedantham. Ion Exchange Chromatography of Proteins and Clearance of Aggregates. Current Pharmaceutical Biotechnology, 2009, 10, 421-426；Pete Gagnon. IgG Aggregate Removal by Charged-Hydrophobic Mixed Mode Chromatography. Current Pharmaceutical Biotechnology, 2009, 10, 427-433.），这样会使蛋白收率降低，成本增加。Gagnon等人提出采用羟基磷灰石层析技术来去除聚集体（US Patent 2010/0145029 A1；US Patent 2005/0107594 A1），该方法去除聚集体的能力很高，可以将60%的聚集体去除到0.1%以下，但是，羟基磷灰石介质的使用寿命短，大规模装柱困难，且对缓冲液条件要求严格，因此并不适合在大规模生产中使用（McCue JT, Cecchini D, Hawkins K, Dolinski E. Use of an alternative scale-down approach to predict and extend hydroxyapatite column lifetimes. Journal of Chromatography A, 2007, 1165, 78-85.）。