[发明专利]一种适用于DNA扩增技术的中药材基因组DNA提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速提取中药材基因组DNA的方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

1985年问世的PCR反应(聚合酶链式反应)是一种体外核酸扩增技术，因其具有敏感性高、特异性强、操作简便、重复性好，易于自动化的特点，已被广泛用于生命科学、医学、药学的各个领域，成为医药研究不可或缺的手段。除此之外，等温扩增技术包括Q复制酶反应(QBRA)、链置换扩增技术(SDA)、切口酶恒温扩增技术(NEMA)、转录依赖的扩增技术(TASTMA、3SR、NASBA)、解旋酶扩增技术(HAD)、滚环扩增技术(RCA)、环介导等温扩增技术(LAMP)、单引物等温扩增技术(SPIA)等简化了对仪器和实验室条件的要求、缩短了检测时间，在中药鉴定领域具有很好的发展前景。(Walker GT，Fraiser MS，Schram JL，et al.Strand displacement amplification「is othermal，in vitro DNA amplification technique.Nucleic Acids Research，1992，20(7)：1691-1696；Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，ct al.Loop「mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic Acids Research，2000，28(12)：63.)

DNA扩增技术的第一步是模板DNA的制备，即样品中DNA的提取。长期以来DNA的提取一直是PCR检测过程中最耗时，繁琐的步骤，严重影响了检测的速度。对于中药研究来说，中药材品种繁多，各品种差异大，基因组DNA提取的工作量非常巨大。传统的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法或SDS(十二烷基硫酸钠)法通过使用CTAB或SDS裂解细胞，酚/氯仿抽提蛋白质，异丙醇沉淀DNA，乙醇洗涤，适用于大多数中药材基因组DNA的提取。然而，CTAB法或SDS法流程繁琐、操作复杂，一般需要5小时以上才能提取出DNA。并且操作过程中使用了大量的酚/氯仿、β-巯基乙醇、异丙醇的有机溶剂，有损于操作人员的身体健康。

发明内容

本发明的目的是提供一种可大规模、简单快速的中药材基因组DNA提取方法，用于DNA扩增技术鉴别中药材及研究遗传多样性。本发明通过以下技术方案实现：

(1)取供试品中药材20-50mg，置于粉碎机中研磨至可过40目筛，放入2.0mL的微量离心管内。

(2)加入200-400μL、0.25-0.6mol/L的氢氧化钠溶液，混匀2-3min。

(3)加入1600μL、100mmol/L的Tris-HCl溶液(pH＝8.0)，温和混匀。

(4)12000rpm下离心2min。

(5)取50μL上清至一新的1.5mL离心管，加入450μL、100mmol/L的Tris-HCl溶液(pH＝8.0)。取1μL上清，加入PCR反应体系内进行PCR扩增。

本发明的有益效果主要体现在：(1)本方法具有简单、快速、节约试剂及耗材、污染小等特点，可用于规模化提取。(2)本方法通用性强，对于植物药、动物药的饮片及炮制品均具有良好的提取效果。

为了能更清晰地说明本发明的提取方法，下面结合具体实施案例，对本发明的提取方法进行进一步阐述。

附图说明

图1：植物类中药材PsbA-trnH片段PCR扩增电泳图

1，金银花；2，红花；3，辛夷；4，藿香；5，人参；6，苍耳子；7，枸杞子；8，车前子；9，葶苈子；10，菟丝子；11，石楠叶；12，紫苏叶；13，苦参；14，葛根；15，当归；16，预知子；17，白芍；18，厚朴(发汗)；19，竹叶；20，黄芩；21，丹皮；22，龙胆；23，大黄(酒制)；24，吴茱萸(甘草制)；25，大血藤；26，黄连；27，鸭趾草；28，草乌(煮制)；29，苦参；30，山药(蒸制)；31，槐米；33，草豆蔻；34，甘草(炙)；35，姜黄；36，决明子。

图2：动物类中药材COI片段PCR扩增电泳图

M，DL2000DNA marker；N，阴性对照；1，乌梢蛇；2，金钱白花蛇；3，土鳖虫；4，地龙；

图3：乌梢蛇特异性鉴别引物PCR扩增电泳图

M，DL2000DNA marker；N，阴性对照；1，乌梢蛇；2，金钱白花蛇；3，地龙；4，全蝎；5，全蝎。

具体实施例1