[发明专利]细胞穿膜肽hPP10的生产及其介导质粒DNA转染的方法

权利要求书

1.一种新型人源性细胞穿膜肽hPP10的化学合成方法，包括以下步骤：

（1）用Fmoc基团对α-氨基进行保护的赖氨酸通过一个支臂连结到不溶性载体树脂上；

（2）用TFA(三氟乙酸)溶液洗涤赖氨酸―支臂―树脂，使α-氨基脱保护；

（3）将第二个预先用适当的缩合剂DCC活化的α-氨基保护的异亮氨酸通过耦联反应与赖氨酸形成共酯连接上去；

（4）用TFA溶液洗涤异亮氨酸―支臂―树脂，使α-氨基脱保护；

（5）将第三个预先用适当的缩合剂DCC活化的α-氨基保护的脯氨酸通过耦联反应与异亮氨酸形成共酯连接上去；重复进行上述脱保护、耦联，直到耦合上最后一个氨基酸精氨酸，脱去Fmoc保护基团，合成完成；

（6）将切割试剂加入到肽-树脂中，把肽链从树脂上切割下来，同时也将各个氨基酸上的侧链保护基团从肽链上切割下来，加入乙醚，沉淀多肽，获得多肽粗品；

（7）运用HPLC/MS进行多肽的鉴定和纯化，最终得到所需多肽。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述树脂是羧基树脂（Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resin），合成方法为Fmoc固相合成法。

3.一种新型人源性细胞穿膜肽hPP10的基因工程表达法，采用原核表达方法，包括以下步骤：

（1）设计编码hPP10的两条单链cDNA，两侧带有NdeI和XhoI酶切位点，合成单链寡聚核苷酸链，再将两条单链DNA等量加入水溶液中，经95℃，5分钟，自然冷却至室温使其完成退火，形成互补的双链DNA片段（hPP10）；

（2）利用NdeI/XhoI两种限制性内切酶进行双酶切，37℃温育两小时，将表达质粒pET15b线性化；

（3）进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外透射仪的长波紫外光照射下，切胶回收含线性化质粒pET15b的条带；瞬时离心，将凝胶集中至管底，依切胶回收试剂盒内的操作说明完成切胶回收；

（4）将回收、纯化的线性化质粒DNA片段和退火后的穿膜肽cDNA片段（hPP10）分别进行琼脂糖凝胶电泳，确定连接比例，将混合连接体系置于16℃水浴箱中温育过夜连接；

（5）CaCl₂法制备DH5ａ感受态细胞，运用热休克法以上述连接产物pET15b-hPP10转化感受态细胞，经0.1g/L氨苄青霉素琼脂平板37℃过夜筛选后，挑取单菌落接种于含氨苄青霉素LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；

（6）离心沉淀收集扩增转化细菌，用碱裂解法提取重组质粒，筛选成功构建的阳性克隆pET15b-hPP10，酶切并测序验证；

（7）将验证正确的重组原核质粒pET15b-hPP10转化Rosetta感受态细菌；经0.1g/L氨苄青霉素琼脂平板37℃过夜；

（8）挑取单克隆菌落接种于含氨苄青霉素LB培养基，37℃振荡培养过夜；

（9）用15ml无菌离心管装3.8ml Amp(+)LB液体培养基，接种0.2ml对数生长期的菌悬液（1:20），37℃，250rpm继续培养3h；

（10）于对数生长期细菌培养物中加入40μl 0.1M IPTG至终浓度1.0mM，37℃，250rpm继续培养；

（11）于加入IPTG后6h取样200μl菌悬液；

（12）离心收菌体集沉淀，用等体积1×Sample Buffer重悬，沸水浴5min，制备全蛋白裂解液；

（13）上样，SDS-PAGE检测、鉴定目的肽hPP10表达情况。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述SDS-PAGE分析所表达和纯化的融合肽（hPP10带有6x组氨酸标签），表明可以通过基因工程细菌表达和通过镍柱纯化得到纯的hPP10-6xHis融合肽。