[发明专利]辅助鉴定马铃薯病毒的特异引物对及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种辅助鉴定马铃薯病毒的特异引物对及其应用。

背景技术

马铃薯是世界上仅次于水稻、小麦和玉米的第四大农作物。我国是世界马铃薯第一生产大国，据统计，“十五”期间，马铃薯年均种植面积7015.9万亩，占全世界总面积的1/4，年产量1,415.60万吨，占世界年总产量的1/5。

马铃薯因具有耐旱、耐寒、耐瘠薄、适应性广的特点，全国大部分地区的土壤及气候条件都可满足其生产。中国是一个人口大国，耕地减少和人口增加的矛盾不可逆转，水资源日益紧缺、扩大有效灌溉面积难度较大，大力发展马铃薯产业对确保粮食安全，促进农民增收，振兴农村区域经济具有重要的战略意义。

马铃薯病毒病分布于世界各马铃薯种植区，可导致马铃薯退化，产量降低，严重时减产80%以上，是当前马铃薯生产中的主要限制因子。在我国由北向南马铃薯带毒率逐渐增高，造成我国中部和南部不能自行留种，必须从北部发病轻的地区引种，造成巨大的经济损失。目前马铃薯上已发现多种病毒、类病毒，已报道的有25种以上病毒或病毒病，所幸的是其中仅有少数病毒危害严重，如马铃薯X病毒、Y病毒、S病毒、卷叶病毒等。

目前，对于马铃薯病毒检测方法概括起来主要有3大类。即指示植物法、酶联免疫吸附法（ELISA）、RT-PCR法，以下分别作一介绍。指示植物是经过筛选的对某种病毒有专化性反应的植物。例如千日红对X病毒的反应是接种后在叶片上出现红色病斑；洋酸浆对Y病毒的反应是种后在叶片上出现小枯斑；地霉松对A病毒的反应是在叶片上出现许多小型点状病斑等。早期鉴定PSTV株系的方法是用指示植物Rutgers番茄进行重复接种。但是指示植物法周期长，需要严格的环境条件，很难用于大规模检测。ELISA方法经济简便，快速直观，但其也存在一定的缺点：首先是抗体的制备所需时间长，费时费力，其次它一次只能检测一种病毒，检测多种病毒时灵敏度降低。此外，此法在检测病毒时还经常存在假阳性反应，给脱毒苗的检测带来困难。目前应用于马铃薯病毒检测的试剂盒多利用酶免法，这种方法受到血清学方法本身的灵敏度和假阳性的限制，无法对病毒进行高灵敏度和准确性的诊断。

发明内容

本发明的目的是提供一种辅助鉴定马铃薯病毒的特异引物对及其应用。

本发明提供了一组引物对组合物，由特异引物对甲、特异引物对乙和特异引物对丙组成；所述特异引物对甲由序列表的序列1所示DNA分子和序列表的序列2所示DNA分子组成；所述特异引物对乙由序列表的序列3所示DNA分子和序列表的序列4所示DNA分子组成；所述特异引物对丙由序列表的序列5所示DNA分子和序列表的序列6所示DNA分子组成。

所述引物对组合物可用于辅助鉴定马铃薯病毒。

所述引物对组合物可用于检测待测植物样本是否感染马铃薯病毒。

所述引物组合物可用于制备试剂盒。

所述引物组合物和阳性标准品可用于制备试剂盒；所述阳性标准品为重组质粒甲、重组质粒乙和重组质粒丙；所述重组质粒甲是将序列表的序列7所示的双链DNA分子插入pMD18-T载体得到的重组质粒；所述重组质粒乙是将序列表的序列8所示的双链DNA分子插入pMD18-T载体得到的重组质粒；所述重组质粒丙是将序列表的序列9所示的双链DNA分子插入pMD18-T载体得到的重组质粒。

所述试剂盒的功能为如下（a）或（b）：

（a）辅助鉴定马铃薯病毒；

（b）辅助检测待测植物样本是否感染马铃薯病毒。

本发明还保护一种应用所述引物对组合物辅助鉴定马铃薯病毒的方法，包括如下步骤：

以待测病毒的cDNA为模板，同时采用所述特异引物对甲、所述特异引物对乙和所述特异引物对丙进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；如果所述PCR扩增产物为一种且大小为250-500bp（具体可为381-401bp，更具体可为391bp），所述待测病毒为候选的马铃薯X病毒；如果所述PCR扩增产物为一种，且大小为100-250bp（具体可为221-241bp，更具体可为231bp），所述待测病毒为候选的马铃薯S病毒；如果所述PCR扩增产物为一种，且大小为500-750bp（具体可为614-634bp，更具体可为624bp），所述待测病毒为候选的马铃薯卷叶病毒。

本发明还保护一种应用所述引物对组合物辅助鉴定马铃薯病毒的方法，包括如下步骤：