[发明专利]一种定量PCR法检测CHO细胞DNA残留量的方法及其标准品的建立

说明书

技术领域：

本发明涉及一种快速、准确、灵敏的CHO细胞DNA残留量的定量测定方法及其标准的建立，属于生物制品质量控制中残留杂质检测领域。 

背景技术：

生物制品的质量控制不仅仅是对终产品的质量控制，而是对整个生产过程的质量控制，包括原材料、中间产物、终产品以及生产过程的质控等等。细胞基质作为主要原材料，其质量的优劣，直接影响疫苗等生物制品的质量和产量，尤其是生物制品的安全性。一般认为，细胞基质存在的潜在危险因素包括：促生长蛋白及细胞残留蛋白、潜在病毒、细胞DNA。其中残余DNA一直是人们关注的热点。原代细胞和二倍体细胞在疫苗生产中已成功使用了40多年，证明是安全有效的，无致肿瘤性，因此国内外对于这两类细胞的DNA残留量没有限度要求。由于连续传代细胞(continuous cell lines，CCLs)调控生长的基因失调，使得传代细胞系具有无限的寿命。因此，理论上认为传代细胞系的DNA具有使其他细胞生长失控和产生致瘤活性的潜在能力，需要对其DNA残留量进行质量控制。 

由于残余DNA存在着潜在的危险性，许多机构对生物制品DNA残留量制定了相关标准。WHO和欧盟建议每人份传代细胞的纯化产品中可接受的残余DNA含量为10ng；美国FDA将生物制品可以允许的残余DNA限度修改为不超过100pg·剂量^-1；对于大剂量的制品(如单克隆抗体)，DNA残留量放宽到10ng·剂量^-1也是可以考虑的，这主要取决于残余DNA的来源以及产品的给药途径。《中国药典》三部2010年版规定原核生物其DNA残留量应不高于10ng·剂量^-1，CHO细胞DNA残留量应不高于100pg·剂量^-1。但由于外源DNA宿主种类繁多，片段大小不一，属于微量杂质，测定时干扰因素较多，如何对其进行灵敏、快速、准确的检测是一项困难的工作。 

目前2010年版《中国药典》三部外源DNA残留量检测项目上收录了DNA杂交法和荧光染色法。DNA杂交法需要的条件相对简单，但该方法存在时间长，操作繁琐，稳定性、敏感性、特异性较差的缺点。荧光染色法是利用PicoGreen这种高灵敏度的双链DNA荧光染料对DNA含量进行定量测定。该方法经中检院检验灵敏度可达300pg·mL^-1，DNA含量在1.25～80ng·mL^-1范围内线性良好(R²≥0.99)。该方法缺点为容易受到RNA、ssDNA、dsDNA的干扰；对于大剂量的产品，比如单克隆抗体，灵敏度难以达到检测需求。 

实时定量PCR是一种快速的高通量的检测方法，它是基于PCR扩增时，在加入一对引 物的同时加入一个特异性的荧光探针；产物的增加可以通过荧光信号指示，通过实时监控PCR体系中的荧光信号，对样本中初始模板进行定量分析。该方法在特异性、灵敏性、准确性方面具有其独特的优势；此外定量PCR不仅能对残余DNA进行定量，还能对DNA片段的分子量分布进行测定，对残余DNA风险的评估更加客观，因此定量PCR法是残余DNA测定未来的发展趋势。在定量PCR检测中，还需要建立样品前处理方法，此外，建立统一的DNA含量测定标准品也是残余DNA检测方法标准化的重要前提。 

发明内容：

1.发明目的： 

提供一种定量PCR法检测CHO细胞DNA残留量的方法及其标准品。 

2.技术方案： 

本发明首先通过QIAGEN Genomic-tip 500/G以及基因组DNA纯化试剂进行CHO细胞基因组DNA的抽提纯化。将抽提的CHO细胞基因组DNA利用紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳进行含量和纯度分析后分装。通过6家实验室利用紫外分光光度法进行协作标定和统计分析后确定最后标准品含量。通过-20、4、25、37℃四个温度下放置4个月以及-20℃保存1年来评价标准品的稳定性。该标准品为国内首批CHO细胞DNA含量测定用标准品并已进行了国家标准品的申报。 

所述标准品可用于定量PCR检测。