[发明专利]制备棘白菌素B母核的方法

说明书

技术领域

本发明涉及抗真菌药物的开发，具体地，本发明涉及一种制备阿尼芬净前体棘白菌素B母核的方法。

背景技术

由于广谱抗真菌药物的大量使用，真菌耐药性逐渐增强。在一些免疫抑制患者包括HIV感染者、器官移植者以及那些患有其它疾病而正进行免疫治疗的患者中，真菌感染无论是其发生频率还是感染种类都在不断地增加。因此，迫切需要寻找新的安全有效的抗真菌药物。

20世纪70年代发现的棘白菌素类药物为一组天然产物，结构由相似的环状多肽核心和不同的脂肪酸侧链组成，通过非竞争性作用机制抑制β-(1，3)-D-葡聚糖的合成，导致细胞壁葡聚糖的排空、渗透不稳定以及真菌细胞的溶解而发挥其抗真菌作用。其作用机制独特，不良发应率低，作为一种可杀死真菌的药物表现出抗菌谱广、活性强的特点，是治疗免疫抑制患者和免疫正常患者真菌感染的重要选择药物。棘白菌素类抗生素主要有三种类型：B，C和D。其中棘白菌素B(Echinocandin B，简称为ECB)是最主要的类型。ECB由于酰基侧链的存在，使其具有一定的溶血毒性。以ECB为先导化合物进行结构改造，可以得到一些具有临床应用价值的化合物，如卡帕芬净(Caspofungin，MK991)、米卡芬净(Micafungin，FK463)、阿尼芬净(Anidulafungin，LY303366)。将ECB的侧链通过脱酰基化断开后生成棘白菌素B母核(Echinocandin B Nucleus，简称为ECBN)，再接上修饰基团构成阿尼芬净，此药已经上市，表现出了优秀的临床效果，市场潜力巨大。

ECBN是通过游动放线菌对棘白菌素B进行脱酰基化得到的，文献DEACYLATION OF ECHNOCANDIN B BY ACTINOPLANES UTAHENSIS(MAR 1989THE JOURNAL OF ANTIBIOTICS)介绍了其分离纯化的方法：首先用HP-20大孔吸附树脂对转化液进行初步分离，然后用反相HPLC进行精制，此法能够得到高纯度的ECBN，但该工艺对设备要求高，制备成本巨大，很难进行规模化生产。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明提供一种新的制备棘白菌素B母核的方法，所述方法工艺简单，设备要求低，适合大规模的工业生产，具有很好的商业价值。尤其是，本发明方法能将棘白菌素B母核的最终纯度提高到95％以上。

因此，本发明涉及制备棘白菌素B母核的方法，所述方法包括如下步骤：

1)棘白菌素B转化完成后抽滤，取滤液，过酸性氧化铝柱；

2)将步骤1)收集液的pH调至4-5，旋蒸浓缩，上大孔非极性树脂，水洗除盐，甲醇水溶液梯度洗脱；

3)将步骤2)合并收集液的pH调至6-7，上反相填料层析柱，甲醇水溶液洗脱；

4)将步骤3)收集液的pH调至4-5，旋蒸浓缩，冻干得棘白菌素B母核。

步骤1)结束后，棘白菌素B母核的收率为95％以上，液相纯度为55-65％；步骤2)结束后，棘白菌素B母核的收率为70％以上，液相纯度为85-90％；步骤3)结束后，棘白菌素B母核的收率为90％以上，液相纯度为95％以上；上述方法的总收率在60％，棘白菌素B母核终纯度在95％以上。

根据本发明的一个优选的实施方式，步骤1)中含棘白菌素B母核的转化滤液过酸性氧化铝柱，能够有效吸附转化液中色素和部分极性杂质而棘白菌素B母核不会被酸性氧化铝吸附，减轻后续步骤的上柱压力。优选地，所用酸性氧化铝规格为：层析用FCP，100～200目。

根据本发明的一个优选的实施方式，步骤2)中将步骤1)收集液旋蒸浓缩后上大孔非极性树脂柱后，先用2-3CV去离子水洗脱除盐，后用5-10％甲醇水溶液洗脱去除极性较大杂质以及残留色素，再用15-20％甲醇水溶液将棘白菌素B母核洗脱下来，此过程中分部收集，合并棘白菌素B母核液相纯度85％以上的洗脱液。优选地，本步骤中使用的5-10％甲醇水洗脱液体积为2-3CV，15-20％甲醇水洗脱液体积为3-4CV。优选地，大孔非极性树脂选自骨架材料为苯乙烯-二乙烯苯类树脂。

根据本发明的一个优选的实施方式，步骤3)中上柱后用甲醇水溶液洗脱，分部收集，合并纯度95％以上的洗脱液。旋蒸浓缩，冷冻干燥后制得白色至淡黄色粉末状棘白菌素B母核。优选地，本步骤中所用的甲醇水洗脱液体积为3-4CV，甲醇浓度为15-25％。

根据本发明的一个优选的实施方式，以上各步骤中，上柱流速均可为1％CV/min，洗脱流速可为1-2％CV/min。