[发明专利]一种木聚糖酶的发酵方法及发酵培养基

说明书

技术领域

本发明属于发酵领域，具体涉及一种木聚糖酶的发酵方法及发酵培养基。

背景技术

木聚糖是植物半纤维素的主要成分，是自然界中广泛存在的、含量仅次于纤维素的可再生性多糖资源。木聚糖酶，主要是由β-1，4-D-内切木聚糖酶和β-1，4-D-外切木糖苷酶组成，此外还有一些脱支链酶，如α-L-呋喃型阿拉伯糖苷酶、α-葡萄糖醛酸苷酶、乙酰木聚糖酯酶等，其可降解木聚糖中的β-1，4糖苷键，这一作用既可降低木聚糖的粘性和抗营养性，又可产生具保健和调节胃肠功能的低聚木糖，因而有广泛的应用前景。国内外众多研究均已证实木聚糖酶应用于畜牧生产中，可改善畜禽消化道功能、增强免疫力、提高饲料利用率和生产性能、减少粪便对环境的污染；应用于食品工业，可提高食品品质和加工效率，还具保健功能；应用于造纸工业，则可大大减少毒性漂白剂的使用，降低纸的脆性，有效减少有毒废液对环境的污染。

虽然木聚糖酶的应用价值早已在世界范围内得到确认，但由于该酶在天然材料中表达水平太低、难以大量生产、并且生产成本昂贵以及木聚糖酶的一些酶活性不能完全满足应用相关条件，因此，到目前为止木聚糖酶并没有得到很好的推广应用。随着基因工程技术的发展，通过基因工程技术这一手段，利用生物反应器则有望成百上千倍地提高其表达量，运用基因工程技术在分子水平上对木聚糖酶进行分子改造，则可望解决一些木聚糖酶活性（如抗逆性、pH值、热稳定性等）的应用缺陷。

国外对重组木聚糖酶的研究开展较早，并先后从天然微生物，如黑曲霉、木霉及芽孢杆菌中克隆出其基因并实现异源表达。但受表达水平的限制，当前市场上销售的木聚糖酶仍然以天然酶为主。然而，微生物在分泌木聚糖酶的过程中，通常伴有其它酶类的分泌，这无疑大大增加了分离纯化的难度和生产成本。何军，“高效木聚糖酶基因工程菌的构建及重组酶没学性质与功效研究”，四川农业大学中公开了一种含有编码里氏木霉木聚糖酶基因序列的重组毕赤酵母工程菌PX-1，其表达产物能够有效分泌至培养基，且杂蛋白分泌量极少，但是产酶水平低，仅为560U/ml，不能满足工业应用的需求，如何进一步提高异源表达水平是实现木聚糖酶工业化廉价生产的关键。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种新的木聚糖酶发酵方法及发酵培养基。

本发明提供了一种制备木聚糖酶的方法，它包括如下步骤：

ⅰ、取包含SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的重组毕赤酵母菌，接种到YPD种子培养基上，pH为5.4~5.6，温度为29~31℃下培养，制备得到种子液；

ⅱ、取步骤ⅰ制备的种子液，以1~3％的接种量接种到酵母发酵培养基中发酵，发酵pH为5.4~5.6，发酵温度为29~31℃；

ⅲ、碳源耗尽后，饥饿0.5~1h，用甲醇诱导木聚糖酶表达，甲醇的浓度维持为0.5%（v/v），直至酶活出现下降时终止发酵；

ⅳ、收集培养物上清，分离纯化，即得到木聚糖酶。

包含SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的重组毕赤酵母菌，简称毕赤酵母PX-1，是何军，“高效木聚糖酶基因工程菌的构建及重组酶没学性质与功效研究”，四川农业大学博士论文中制备的毕赤酵母工程菌PX-1。

其中，步骤ⅰ所述pH为5.5，所述温度为30℃。

其中，步骤ⅱ所述的接种量为2%，发酵pH为5.5，发酵温度为30℃。

其中，步骤ⅱ所述的酵母发酵培养基每一升培养基包括如下成分：磷酸盐6.5g~55g、钙盐0.23~0.93g、钾盐4.55~18.2g、镁盐3.73~14.9g、氢氧化钾1.03~1.5g、生物素4.73ml、PTM1微量元素溶液4.37ml、甘油40ml。

微量元素（PTM1）（g/L）：五水硫酸铜6.0，碘化钾0.18，一水硫酸锰3.0，二水钼酸钠0.2，硼酸0.02，氯化钴0.5，氯化锌20.0，七水硫酸亚铁65.0，浓硫酸5.0mL。

优选地，所述磷酸盐为磷酸二氢铵、磷酸二氢钾或者六偏磷酸钠。

优选地，所述钙盐为硫酸钙；所述钾盐为硫酸钾；所述镁盐为七水硫酸镁。

优选地，所述培养基每一升培养基包括如下成分：磷酸二氢铵50g，磷酸二氢钾5g，二水硫酸钙0.93g，硫酸钾18.2g，七水硫酸镁14.9g，氢氧化钾1.5g，甘油40mL，生物素4.73mL，PTM1微量元素溶液4.37mL。