[发明专利]一种卤醇脱卤酶的生产方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种利用基因工程菌发酵生产卤醇脱卤酶的方法。

背景技术

有机卤化合物已成为当今社会的重要环境污染物之一，这主要是由于工业排废以及人工合成卤化物在化工合成以及农业上的广泛应用造成的。在自然界中，大部分异生质卤化物自降解能力很差，同时许多化合物被疑是致癌或高诱变物质。因此，应用微生物降解有机卤化物已引起人们广泛的关注。从1968年Castro首次发现以2,3-二溴丙醇作为唯一的碳源而生存的黄杆菌菌株至今，人们相继筛选到多种可以降解邻卤醇的微生物，其中包括从淡水沉淀物中分离的放射形土壤杆菌菌株AD1和节杆菌菌株AD2以及从土壤中获得的棒状杆菌菌株N-1074等。它们降解有机卤化物的途径虽然存在明显差异，但是卤醇脱卤酶作为关键酶之一，催化碳卤键的断裂存在于所有的代谢途径中。由于卤醇脱卤酶具有很高的选择特异性 (enantioselectivity)，因此在合成光学纯卤醇、环氧化物及二醇等重要手性药物中间体方面也具有很重要的应用价值。

野生型卤醇脱卤酶存在活性低和选择性较差的缺陷，使其应用受到限制。通过基因工程和分子定向进化技术，改造天然的卤醇脱卤酶，并在大肠杆菌表达系统中高效表达，可以提高卤醇脱卤酶的酶活性、底物选择性和产量。在专利申请号为200810186576.6的专利中，安琪酵母有限公司通过以上方法开发的卤醇脱卤酶的酶活性已经提高到450U/ml。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中的卤醇脱卤酶活性不高等问题，提供一种酶活性和产量更高、生产成本更低的卤醇脱卤酶生产方法。

为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：

一种卤醇脱卤酶的生产方法，包括以下步骤：

（1）、构建基因工程菌，配制摇瓶种子培养基和发酵培养基；所述基因工程菌为表达了卤醇脱卤酶的重组大肠杆菌；

（2）、使基因工程菌斜面活化20~25小时，再将活化后的基因工程菌接种至装有摇瓶种子培养基的摇瓶中，在37℃的条件下振荡培养8~15小时，得到种子液；

（3）、将经步骤（2）振荡培养后的种子液接入发酵培养基中进行发酵，按体积比，接种时种子液/发酵培养基=1%~10%；发酵培养的温度控制在25~37℃，发酵液的pH值控制在6.5~7.0；当发酵液中的细胞光密度≥20时，向发酵液中添加诱导剂，且诱导剂在发酵液中的加入质量占发酵液总量的0.01%~0.2%；然后继续发酵10~15小时；

所述发酵培养基的组成包括：酵母粉9~15g/L、甘油4.5~7.5g/L、NaCl 8~11g/L、NaNO₃ 1~2g/L，KH₂PO₄ 2~3g/L，K₂HPO₄ 12~13g/L，微量元素2~5mg/L；

（4）、步骤（3）完成后，采用常规方法从步骤（3）所得发酵液的培养物中取得卤醇脱卤酶，经后续处理，完成整个生产过程。

根据本发明，所述发酵培养基中的微量元素包括CoCl₂·6H₂O、MnCl₂·4H₂O、CuCl₂·4H₂O和生物素。

在本发明的一个优选实施方式中，所述发酵培养基的组成包括酵母粉12g/L、甘油6g/L、NaCl 10g/L、NaNO₃ 1.44g/L、KH₂PO₄ 2.4g/L，K₂HPO₄12.5g/L，微量元素2~3mg/L。