[发明专利]特异性检测转基因大豆DP-356043的标准质粒分子及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种特异性检测转基因大豆DP-356043的标准质粒分子及其应用，属于生物检测技术领域。

背景技术

近年来，玉米、大豆、油菜、棉花、番茄等转基因作物已在许多国家允许种植和生产，并被广泛用作食品或饲料的加工原料。由于转基因产品存在着生态风险和食品安全等一系列的问题，因此，世界各国政府和相关国际组织纷纷制定相应的安全管理法规，加强遗传改良作物的规范管理，并对遗传改良作物及其产品实施标识制度。我国于2001年5月9日公布并实施《农业转基因生物安全管理条例》，并在2002年1月5日公布了农业转基因生物安全评价、标示和进口安全管理三个配套管理办法。为了应对遗传改良作物管理相关的法律法规和制度，建立高效、快速、特异的检测技术十分必要，它是各国际组织和国家管理遗传改良作物的有力技术支撑。

目前已经发展并广泛应用的转基因产品检测方法有两类：一类是基于核酸水平的检测，另一类是基于蛋白质水平的免疫学检测。基于核酸的聚合酶链反应（PCR）检测技术因具有高灵敏度和特异性强的优点，已成为目前最重要、应用最广泛的遗传改良作物及其产品检测技术。不论采用基于核酸或蛋白质的方法，在进行转基因检测时都应使用标准物质作为阳性对照，以确保检测过程的有效和检测结果的可靠性。目前，用于转基因检测的阳性标准物质主要是用纯合的转基因植物材料配置的，位于比利时的欧盟联合研究中心下属的标准物质与测量研究所(Institute for Reference Materials and Measurements，IRMM)专业配制和提供用于转基因定量PCR检测的阳性标准品。到目前为止仅得到了十几种遗传改良作物的标准物质，在市场上销售。但这类来源于农产品的标准物质，其必须有专门的研究机构来制备，贮存和测定过程受很多因素影响，很难维持恒定的量，价格昂贵，而且，这些标准物质的转基因含量范围一般是从0.1%到5%，而实际检测的样品中的转基因含量可能会超出这个范围。标准物质的缺乏已成为检测方法建立和应用的瓶颈，阻碍了转基因产品标识制度的顺利实施。

标准质粒分子是一种重组质粒分子，其中一般包含转基因作物检测的外源基因片段或品系特异性片段以及物种特异性片段。标准质粒分子的优点主要是可以通过微生物进行大量培养，纯度较高；且操作容易，稳定性高，同一个标准分子可以同时包含多个外源目的基因和内标准基因，经济高效。近年来，越来越受到各国转基因检测专家和学者们的重视，并逐渐取代传统阳性标准品用于转基因品系及其加工产品的PCR检测。

转基因大豆DP-356043品系由先锋公司研发，已先后在美国、加拿大和日本三国批准环境释放，并在澳大利亚、韩国、菲律宾、墨西哥等8个国家和地区批准用于食品和饲料的加工原料。我国虽然不种植转基因大豆，但每年都进口几千万吨转基因大豆用于食品或饲料加工原料。迄今为止，还没适用于转基因大豆DP-356043品系检测的标准质粒分子的报道。

发明内容

为了给中国转基因大豆品系监管提供必要的技术支撑，开发适用于转基因大豆DP-356043品系特异性检测的、稳定可靠的标准质粒分子，本发明提供了一种特异性检测转基因大豆品系DP-356043的标准质粒分子及其应用。

本发明所提供的标准质粒分子，其包含以下序列片段：DP-356043品系特异性片段和大豆内源标准基因Lectin的特异序列片段。 

所述的DP-356043的品系特异性序列，指的是转基因大豆品系DP-356043的外源插入载体与大豆基因组邻接区的DNA序列如SEQ ID NO:1所示。

所述大豆内源标准基因Lectin特异性片段，指的是大豆凝集素基因片段，其DNA序列如SEQ ID NO:2所示。

所述的标准质粒分子的骨架质粒是pMD18-T。

所述的用于转基因大豆检测的标准质粒分子，其中用于构建标准质粒分子的引物序列如下（表1）：  

表1 构建标准质粒分子的PCR引物

所述的用于转基因大豆检测的标准质粒分子的构建方法，包括以下步骤：

以转基因大豆品系DP-356043基因组DNA为模板，用表1中设计的引物进行PCR扩增；反应体系为：总体积为50μl，其中10倍的PCR反应液5μl，dNTPs 4μl,上下游引物（20μM）各1μl，模板5μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，用ddH₂O补足至50μl；