[发明专利]一种提高Bt杀虫蛋白在汉逊酵母中表达量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及使用一个复合增强子以实现Bt融合蛋白基因在多型汉逊酵母细胞中以组成型方式高效表达的方法，其中包括：1)使用一个复合增强子以提高密码子优化后的Bt融合蛋白基因在汉逊酵母中的产量；2)采用毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子调控Bt融合蛋白基因在汉逊酵母中以组成型的方式表达；3)优化后的汉逊酵母发酵培养生长条件；4)利用纳滤及镍柱亲和层析快速提纯该重组外源蛋白的方法。而由此方法制备的Bt重组融合蛋白可作为蛋白质标准物质备选物应用于蛋白质溯源研究等领域。

背景技术

Bt是苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)的简称，属革兰氏阳性上壤芽胞杆菌。该细菌产生的Bt杀虫毒蛋白能够破坏昆虫肠道内的细胞渗透压，造成消化紊乱，最终导致昆虫死亡。Bt基因是第一代抗虫基因的典型代表，它表达的蛋白统称为Cry晶体蛋白。根据杀虫谱及氨基酸序列同源性的不同，Bt基因被分为不同的类型，其中Cry1Ab和Cry1Ac对鳞翅目害虫具有专一性毒性，而其它的Bt基因则对双翅目或鞘翅目等害虫具有专一毒性。Bt基因通过生物技术手段转入作物后，能够表达具有杀虫活性的毒蛋白并使植物具备抗虫性。目前，国内外已经获得转Bt基因的作物有棉花、水稻、玉米、小麦和油菜等。

虽然现在市场上有许多可用于Bt转基因蛋白质测定的试剂盒，但不同的厂商可能采用不同的工艺表达、分离纯化原料，以及不同的方法确定参考物质的量值，而蛋白质检测标准物质和量值溯源传递体系的严重缺乏使得不同试剂盒内所带参考物质不能溯源到上一级的计量标准，也就无法保证不同试剂盒所带参考物质量值的准确性与可溯源性，造成测定结果不准确和缺乏可比性，对生物安全监管带来隐患，由此产生一系列法律、贸易等经济和社会问题。因此，在我国范围内，尽快研制Bt蛋白标准物质，建立起灵敏准确的定量测定方法及Bt转基因植物蛋白量值溯源传递体系，对于今后保证测定结果的溯源性、准确性和可比性，显得十分迫切且意义重大。

近几年来，随着人们对汉逊酵母(Hansenula polymorpha)生物学特性的深入研究，发现其作为外源基因表达宿主的优势逐渐显现。汉逊酵母也是一种甲醇营养型酵母，与毕赤酵母类似。汉逊酵母中甲醇代谢的主要途径有两种(Lodeboer A.M.，et al.，1985)：一种是在过氧化物酶体中进行，甲醇在甲醇氧化酶(methanol oxidase，MOX)作用下生成甲醛和H₂O₂，甲醛再经甲醛脱氢酶(formaldehyde dehydrogenase)和甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase，FMD)作用下生成CO₂，H₂O₂在过氧化氢酶(catalase，CAT)的作用下生成H₂O和O₂；甲醇的另一个代谢途径发生在过氧化物酶体外，甲醇在细胞质中经过一系列酶的催化作用最后转变为糖类，其中二羟丙酮合成酶(dihydroxyacetone synthase，DHAS)是这一过程的关键酶。甲醇代谢过程中的各种关键酶，包括MOX、DHAS和CAT等的表达都是在转录水平进行调解的，它们受甲醇、甘油和山梨醇的诱导，受葡萄糖和乙醇的阻遏，但当葡萄糖浓度低于0.1％时，阳遏作用即被解除。在甲醇完全诱导条件下，过氧化物酶体可占细胞总体积的80％，MOX和DHAS可占细胞总蛋白的15％，它们的启动子具有极强的启动下游基因表达的功能，目前已被用作外源基因在酵母中表达的常用启动子。诱导型启动子以其强启动功能和严紧的调控机制被广泛的应用于外源基因的表达，已有很多外源蛋白在这些启动子的调控下在汉逊酵母细胞中得到高效的表达。目前用于汉逊酵母外源蛋白表达系统的诱导型启动子都需要在一定剂量甲醇存在的条件下才能发挥作用，但由于甲醇是有毒物质，且易燃易爆，这样就限制了该系统在医药或食品等领域的应用。因此，各种组成型启动子就应运而生，已经成功应用于汉逊酵母外源蛋白表达系统的组成型启动子有质膜ATPase启动子(pPMA1)和翻译延伸因子1a启动子(TEF1)等，这些组成型启动子的应用不仅无需在发酵培养基中加入甲醇，而且也简化了发酵工艺和降低了成本等。