[发明专利]一种提高埃博霉素B产率的生物合成方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种埃博霉素的生物合成方法，具体地说是一种工业化生产提高埃博霉素B产率的生物合成方法，属于抗生素微生物发酵培养领域。

背景技术

埃博霉素B属于大环内脂类抗生素新成员，埃博霉素是一类具有独特结构和独特生物活性的抗生素。其分子结构如下：

埃博霉素A

埃博霉素B

其中埃博霉素B是由粘细菌(纤维对囊菌)产生的大环内酯类化合物，埃博霉素B不但具有抗肿瘤作用，对于真菌感染的皮肤病也有良好的拮抗、治疗作用，埃博霉素B毒性低、副作用小，具有良好的应用前景，但目前通过发酵制备埃博霉素B的方法生产成本高，培养所产生的活性物质中埃博霉素B产率低，生产波动性大，最高只占22％以下，有的甚至只有痕迹量。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中埃博霉素B生产成本高及低产率的问题，而提供一种高产率的、能适应工业化生产并能有效地降低生产成本的埃博霉素的生物合成方法，采用本方法扩培、发酵产生的活性产物中埃博霉素B的产率高达到30～45％，具有良好的工业化生产前景。

为了实现上述的目的，本发明所采取的技术方案是：提供一种提高埃博霉素B产率的生物合成方法，包括如下步骤：

(1)、生产出发菌种，Soce90-G15：通过3000rpm离心摇瓶菌液选取生长健壮的粘细菌作为生产出发菌种；

(2)、固体斜面扩培：培养基的组分按质量％计为，葡萄糖0.5～1％、蛋白胨0.3～0.5％、淀粉0.5～1％、氯化钠0.1～0.5％、赤霉素0.002％和琼脂粉2％，余量为水；培养基在120℃、30分钟灭菌冷却后布置成斜面，24小时后把生产出发菌种涂布于斜面上，在30±2℃、相对湿度55％，7～9天可见生长丰满、金黄色的菌苔，冷藏待用；

(3)、摇瓶扩培：摇瓶培养基为淀粉5～8g/L、酵母提取物2～4g/L、葡萄糖0.5～1.5g/L、MgSO₄ 1g/L、CaCl₂ 1g/L、甘油0.5～1g/L、磷酸二氢钠0.05g/L、豆饼粉2～4g/L，饮用水1升，调PH为7.20、在120℃、30分钟灭菌；把固体斜面的菌苔轻轻刮下接入摇瓶培养基，在29℃±1℃、转速150rpm下，生长5～6天；选取菌体生长健壮的摇瓶菌种液转接入一级种子罐；

(4)、一级种子培养：一级种子培养基的组成与摇瓶培养基相同，也在120℃、30分钟灭菌；把生长好的摇瓶菌种液通过压差法接入一级种子罐中扩培，培养温度29±2℃、转速120rpm、空气流量比1比0.4、罐压0.04kg/cm²，培养5～6天，将生长旺盛的菌种液转接入二级种子罐；

(5)、二级种子罐培养：二级种子培养基的组成与摇瓶培养基相同，也在120℃、30分钟灭菌；把生长好的一级菌种液通过压差法接入二级种子罐中扩培，培养温度29±2℃、转速120rpm、空气流量比1比0.5、罐压0.04kg/cm²，培养2～3天，将生长旺盛的菌种液转接入发酵罐；

(6)、发酵罐培养：发酵培养基的组成与摇瓶培养基相同，但外加前体诱导物0.2～0.5g/L、大孔吸附树脂20g/L；PH调整至7.30，120℃、30分钟灭菌；把生长好的二级菌种液通过压差法接入发酵罐中扩培，培养产品的温度29±2℃、转速150rpm、空气流量比1比0.8、罐压0.04kg/cm²、培养10～11天；

(7)、洗涤、洗脱：发酵至残糖低于0.2％，在代谢活性物质产出高点时终止发酵，将发酵液中的的树脂分离出来淘洗干净装入树脂床内；用50％甲醇洗涤1倍柱床量、流速25ml/min，脱色、除杂；再用6倍柱床量乙酸乙酯，流速15ml/min洗脱埃博霉素A、埃博霉素B活性物质，收集洗脱液；

(8)、真空浓缩：把收集的含活性物质的洗脱液真空浓缩，温度40～45℃、真空度-0.085～-0.095MPa，浓缩至原始体积量的1/15以下；

(9)、液相制备柱分离：把浓缩液通过液相制备柱分离收集埃博霉素B部份分离液；

(10)、萃取：把收集的含埃博霉素B分离液真空浓缩至剩余水相，加入有机溶剂进行萃取分离收集有机相；

(11)、结晶：把收集的有机相真空浓缩，温度40～45℃、真空度-0.085～-0.09MPa、浓缩至原始体积量的1/10以下；把浓缩液放入洁净的结晶器中-20℃低温结晶；