[发明专利]一种提高传代细胞系冻存细胞复苏率的复苏方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞生物学技术领域，涉及体外传代细胞培养技术，更具体涉及一种提高传代细胞系冻存细胞复苏率的复苏方法。

背景技术

在生物学技术飞速发展的当今，人们在细胞生物学及其相关学科的研究中，越来越多的运用细胞培养增殖技术，将有研究意义或有应用前景的细胞采用低温度进行长期保存数年，数十年甚至百年，一旦需要，可随时对所保存的细胞进行复苏，恢复其完整的形态结构与生物学特性，供生命科学研究实验。

复苏率是指：在长期冷冻保存状态下的细胞，经过复苏过程，恢复其活性与生物学特性的细胞数量占冻存细胞总数的百分比。

影响细胞复苏率的因素有三部分：降温冷冻过程、低温下保存过程及升温复苏过程。

冻存细胞复苏后16-24小时，在普通光学显微镜下观察：当复苏率小于40％时，见活细胞较少而且形态不规则，生长繁殖速度缓慢，甚至停止生长死亡，导致细胞保存失败；当复苏率大于40％且小于70％时，显示部分成活细胞，细胞大小不均匀，生长繁殖速度慢，培养5-7天才能生长成单层细胞；当复苏率大于80％时，显示成活细胞较多，细胞形态正常，生长繁殖速度快，培养2-3天就能生长成单层细胞。

综上所述，升温复苏过程，是直接影响人工培养细胞增殖是否成功和顺利进行的一个关键技术。复苏率的高低是直接影响细胞生长质量与增殖周期的重要因素。所以复苏的方法对复苏率有重要和直接的影响作用。

数十年来，大量国内外生物细胞学技术相关书籍，介绍常规的复苏方法如下操作：

1、从液氮中取出细胞冻存管，置37℃水浴，180-300秒融化，加入适配营养液，800转/分钟离心5分钟，弃上清，加入适配生长液适量，静止37℃培养；

2、16-24小时镜下观察复苏后的细胞状态，可见约60-70％的细胞贴壁生长，细胞形态边缘不光滑，有凹凸，大小不均匀，折光性差，培养液中有大量悬浮圆缩的无活力细胞；

3、更换适配生长液，继续培养至48小时；

4、镜下观察细胞未生长成单层，60-80％融合，继续培养至72-96小时，细胞完全融合，按比例传代培养；

5、完成细胞复苏生长繁殖周期。

以上广泛使用的复苏温度37℃，再者由于聚丙烯冻存管在实际中的大量广泛应用，造成传热性的差异，一般要180-300秒才能溶解完全，每分钟复温25～50℃，在排除其它影响因素的情况下，复苏率为40-80％。

发明内容

本发明目的是提供一种提高传代细胞系冻存细胞复苏率的复苏方法，该方法能保持细胞壁的完整，溶解速度更快，以达到使细胞形态结构与生物学特性恢复的更完整，复苏时间短，且复苏率高。

为了达到上述发明目的，本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明提供一种提高传代细胞系冻存细胞复苏率的复苏方法，其特征在于步骤如下：

(1)从液氮中取出细胞冻存管，复苏温度46-67℃下水浴30-70秒，加入适配营养液，800转/分，离心5分，弃上清，得离心后的细胞；

(2)离心后的细胞用适配营养液稀释，无菌取细胞，用1％台盼蓝染色，计数活细胞数和细胞总数，计算复苏率为95-98％；

(3)其余细胞加入适配生长液，静止37℃培养5-7小时，至90-95％的细胞贴壁；

(4)更换细胞适配生长液继续培养48-72小时，至细胞完全融合生长成单层；按比例传代培养；完成细胞复苏生长繁殖周期。

进一步，所述的复苏温度为55-60℃。

在复苏过程中，冰晶在-50℃以上时进行得较快，因而缓慢解冻往往会由于重结晶而造成细胞死亡，迅速升温可使重结晶的晶体数量减至最少，也可使细胞处在高浓度溶质中的时间缩到最短，以减少细胞的“渗透压休克”，恢复细胞的正常生理功能。本发明与现有技术相比，复苏温度提高，复苏时间缩短，溶解速度更快，复苏速度分别可达100-250℃/min，复苏时间在30-70秒，6小时后镜下观察复苏后的细胞状态，可见约90-95％的细胞贴壁，细胞形态圆形，大小均匀，折光性好，有部分分支生长状态，培养液中有少量悬浮圆缩的无活力细胞；最终的细胞复苏率达90-98％，提高了传代细胞系冻存细胞的复苏率，保证了细胞生长质量，保持了细胞壁的完整，缩短了细胞复苏的增殖周期。

通过下列实施例将更具体的说明本发明，但是所述实施例仅是为了说明本发明，而不是以任何形式限制本发明的保护范围。

具体实施方式