[发明专利]一种在酿酒酵母蛋白Rav2p的C末端上快速添加FLAG标记的方法

说明书

技术领域

本发明涉及酿酒酵母中Rav2p基因的改造与修饰，属于分子生物学相关领域。

背景技术

V-ATP酶(VacuolarATPase)是一种普遍存在于真核生物的内膜系统的蛋白质大分子，其可以水解ATP来转移质子，维持细胞的正常生理环境。V-ATP酶在细胞内通过质子的运输，使细胞器的pH平衡，进而对生物学过程例如细胞膜运输、蛋白质降解、小分子的偶联运输起重要作用。

V-ATP酶由两大结构功能部分共14种亚基组成：一部分是水溶性的V₁，由8种亚基组成，主要功能是水解ATP；另一部分是嵌于膜中的V₀，由6种亚基组成，主要功能是转移质子。这两大部分之间形成一种柄状结构从而使得这两部分从功能和结构上成为一个整体。

V-ATP酶在萄糖浓度降低时可以可逆分解为V₀和V₁两部分来调节酶的活性，RAVE：(regμlator of theH⁺-ATPase of vacuolar and endosomal membranes)在V-ATP酶这种活性调节方式中起很重要的作用。RAVE复合物由Skp1p、Rav1p和Rav2p三个亚基组成。目前有关RAVE以及RAVE对V-ATP酶活性调节机理的研究很少，但是有研究发现RAVE通过与V-ATP酶V₁部分的E亚基和G亚基作用从而调节V-ATP酶的活性。V-ATP酶的活性高低直接影响了细胞对酸性环境耐受性的强弱，利用本发明人构建的线性DNA可以实现对Rav2p的基因改造与修饰，或者对在酿酒酵母细胞内Rav2p基因的敲除，从而构建Rav2p基因缺陷型酿酒酵母。这种缺陷型酿酒酵母由于Rav2p的合成能力缺失，RAVE对V-ATP酶的调节机制也被破坏，所以这种缺陷型酿酒酵母对高压二氧化碳敏感，在食品加工过程中具有实际应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种在酿酒酵母蛋白Rav2p的C未端上快速添加FLAG标记的方法。该方法经济有效、方便快捷，不需要设计酶切位点和构建质粒。

本发明提供了一种在酿酒酵母蛋白Rav2p的C末端上快速添加FLAG标记的方法，其特征在于使该菌蛋白Rav2p C末端上带有FLAG标记，并插入抗生素G418抗性基因KanMX6。

一种在酿酒酵母蛋白Rav2p的C末端上快速添加FLAG标记的方法，其步骤如下：

A、提取酿酒酵母BY4742和酿酒酵母SF838-5A RAV1-Myc13的基因组：

(1)从YPD固体培养基上挑取酿酒酵母BY4742单菌落，接种于5ml的YPD液体培养基；从YPD固体培养基上挑取SF838-5A RAV1-Myc13单菌落，接种于5ml的YPD液体培养基，培养过夜；

(2)用500μl的山梨醇缓冲液悬浮酿酒酵母，加入40μl、1000U/ml的lyticase和1μl β-巯基乙醇，混匀后37℃孵育3h，破坏细胞壁；

(3)蛋白酶k和RNase去除组蛋白和RNA；

(4)使用平衡酚和氯仿∶异戊醇(24∶1)分别萃取，离心去除蛋白、多糖等有机质，重复一次；

(5)取上层水相，加入2倍体积无水乙醇，-20℃放置1h，12000r/min离心10min；

(6)弃上清并置于超净台吹干，加入50μl ddH₂O溶解DNA。

B、克隆同源左、右臂和KanMX6：

(1)以酿酒酵母BY4742基因组为模板，通过引物Rfkanp1、Rfkanp2和Rfkanp5、Rfkanp6来分别扩增同源左、右臂；

(2)以酿酒酵母SF838-5A RAV1-Myc13的基因组为模板，通过引物Rfkanp3和Rfkanp4来扩增KanMX6。

C、融合同源左、右臂和KanMX6这三个片段：

以同源左、右臂和KanMX6为模板，通过引物Rfkanp1、Rfkanp6来融合这三个片段，形成一条完整的DNA片段。

D、制作酿酒酵母BY4742感受态：

(1)从YPD固体培养基上挑取酿酒酵母BY4742单菌落，接种于30ml的YPD液体培养基；

(2)离心收集细胞，用无菌水洗涤一次；

(3)用0.1M LiAc处理细胞并分装。

E、将融合产物导入感受态细胞：

(1)将分装的感受态细胞离心收集；