[发明专利]一种在酿酒酵母蛋白Rav2p的C末端上快速添加FLAG标记的方法

权利要求书

1.一种在酿酒酵母蛋白Rav2p的C末端上快速添加FLAG标记的方法，其特征在于使该菌蛋白Rav2pC末端上带有FLAG标记，并插入抗生素G418抗性基因KanMX6。

2.按照权利要求1所述，其特征在于使酿酒酵母蛋白Rav2p的C末端上带有FLAG标记的方法包括如下步骤：

A.设计Rav2p基因终止密码子前400bp片段的一对引物Rfkanp1和Rfkanp2，把这段片段命名为同源左臂，其中Rfkanp2后半部分为FLAG标记的基因序列；

Rfkanp1：GGTGACTAAAAAACCTTGG；

Rfkanp2：cttgtcatcgtcgtccttgtagtcCTTATATGTACTTAACTGTTTGCTA    (FLAG)；

B.设计Rav2p基因下游400bp片段的一对引物Rfkanp5和Rfkanp6，把这段片段命名为同源右臂；

Rfkanp5：TCTACTAGCGATAACATTAACA；

Rfkanp6：ATTAGATTTGATTGAAGAG；

C.以酿酒酵母基因组为模板，通过引物Rfkanp1和Rfkanp2扩增同源左臂；

D.以酿酒酵母基因组为模板，通过引物Rfkanp5和Rfkanp6扩增同源右臂。

3.按照权利要求1所述，其特征在于使酿酒酵母含有抗生素G418抗性基因KanMX6的方法包括如下步骤：

A.设计KanMX6基因的引物Rfkanp3和Rfkanp4；

Rfkanp3：gactacaaggacgacgatgacaagTAGTGAATTCGCGCCACTTC    (FLAG)；

Rfkanp4：TGTTAATGTTATCGCTAGTAGAGAATTCGAGCTCGTTTAAA；

B.以含有KanMX6基因的酿酒酵母SF838-5A RAV1-Myc13基因组为模板，通过引物Rfkanp3和Rfkanp4扩增KanMX6基因；

C.利用融合PCR技术连接同源左臂、抗生素G418抗性基因KanMX6、同源右臂；

D.将连接的DNA片段导入酿酒酵母，接种于含有G418的培养基培养，挑选阳性克隆。