[发明专利]检测混合物中羚羊角成分的方法及所用引物

说明书

技术领域

本发明涉及应用分子生物学技术检测混合物特别是药材中羚羊角成分的方法，具体地涉及检测药材、或者以羚羊角或替代品入药的中药制剂中羚羊角成分的方法，以及该方法中所用到的特异性引物。

背景技术

羚羊角是我国传统的名贵中药，为牛科动物塞加羚羊(Saiga tatarica Linnaeus)的角。具有平肝息风、清肝明目、散血解毒的功效，用于治疗肝风内动、惊痫抽搐、高热痉厥、头痛眩晕等症。但目前对于羚羊角的鉴别主要采用传统形态学方法，依赖鉴别人员经验，主观性高，因此需要一种能够准确、有效的鉴别方法。

另一方面，脊椎动物线粒体基因组大小为16kb左右，呈闭合环状结构，在细胞中呈多拷贝形式存在于线粒体中(依细胞类型不同而异)。动物线粒体基因在进化上保守，且遵循严格的母系遗传特性，因此被广泛用于起源进化分析和物种鉴定。

在含羚羊角成分的混合物例如药材、或者以羚羊角入药的中药制剂等的生产加工过程中，羚羊角中的部分DNA通常能够保留于其中，因此，混合物中的羚羊角成分可以从其携带的DNA检测中获得鉴定。

然而，在混合物特别是药材、中药制剂中羚羊角成分鉴定的研究技术上，由于混合物中羚羊角DNA含量很低，并且含有多种抑制PCR反应的成分，因此，如何能够有效提取其中的DNA是分子生物学技术鉴定羚羊角成分的一个关键；同时，含羚羊角的混合物特别是中药制剂中通常还具有较多的其它动植物物种，如何设计羚羊物种特异性引物也成为鉴定技术的另一关键。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种利用分子生物学技术检测混合物特别是药材、中药制剂中羚羊角成分的方法，以准确、有效地鉴别混合物中是否含有羚羊角成分。

本发明的另一目的在于提供一种用于分子生物学技术检测混合物特别是药材、中药制剂中羚羊角成分的方法中的特异性引物。

本发明的另一目的在于提供了一种用于分子生物学技术检测混合物特别是需要鉴别是否为羚羊角的药材、或者以羚羊角或替代品入药的中药制剂中羚羊角成分的试剂盒，其中包含本发明所述的引物。

为达上述目的，一方面，本发明提供了一种利用分子生物学技术检测混合物中羚羊角成分的方法，该方法主要包括：

从待测混合物中提取总DNA；

以所提取的总DNA为模板，利用特异性引物进行聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)扩增；

对扩增结果进行分析判断。

如前所述，通常，含羚羊角的混合物特别是药材、或者以羚羊角入药的中药制剂中，羚羊角成分含量很低，并还含有较多的其它动植物物种，还可能含有多种抑制PCR反应的成分，在此情况下，设计羚羊物种特异性引物是本发明的分子生物学检测技术的关键之一。

根据本发明的具体实施方案，本案发明人从羚羊角中提取了总DNA，根据NCBI中公布的羚羊线粒体DNA与核DNA序列设计引物，经扩增、测序，提交blastn比对、分析等，设计了本发明的羚羊特异性引物。所设计的羚羊特异性引物为选自如下SEQ IDNos.1和2(本发明中亦将该引物对命名为S1F/R)、SEQ ID Nos.3和4(本发明中亦将该引物对命名为S2F/R)、以及SEQ ID Nos.5和6(本发明中亦将该引物对命名为S3F/R)中的一对、两对或三对引物：

S1F/R：5’-GAAAAACCCACCCACTT-3’(SEQ ID NO：1)/

       5’-TGTGGGTAACAGAGTGG-3’(SEQ ID NO：2)；

S2F/R：5’-CTGCCTATTCATACACGTA-3’(SEQ ID NO：3)/

       5’-TTTGTCCTCATGGTAGG-3’(SEQ ID NO：4)；

S3F/R：5’-CTACACCATTAAAGACATTC-3’(SEQ ID NO：5)/

       5’-ATGCGAATAGGAAGTATCAT-3’(SEQ ID NO：6)。

如前所述，通常含羚羊角的混合物特别是药材、或者以羚羊角入药的中药制剂中羚羊角DNA成分的含量是很低的，如何能够有效提取其中的DNA，是本发明检测羚羊角成分技术的另一个关键。根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，所述从待测混合物中提取总DNA的过程包括以下步骤：

待测混合物经煮沸法处理20～40分钟；

加入CTAB提取缓冲液60℃～70℃消化2～4小时；