[发明专利]一种利用流式细胞术检测细胞胞内蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明属于流式细胞术技术领域，具体涉及一种利用流式细胞术检测细胞胞内蛋白的方法。

背景技术

恶性肿瘤也称为癌症，是目前威胁人类生命和健康的主要疾病之一。癌症的发病率呈逐年上升趋势，尤其是70年代以后，癌症发病数以年均3％～5％的速度递增，不仅如此，癌症的发病年龄还趋于年轻化，已成为人类第二大死因。为此，医学界一直努力探寻对其进行有效的诊治。经过半个多世纪的发展和完善，外科手术、放疗、化疗等方法已经成为恶性肿瘤综合治疗的主要手段，但在临床应用时常常引起严重的毒副作用，其治疗效果并不是很好，治愈率通常较低。大量临床事实证明，癌变初期的治愈率是相当高的。因此，治疗癌症的关键在于有效的早期诊治。目前诊断恶性肿瘤最有效的手段是病理诊断，但准确性往往受限于操作医生的工作经验，早期病变容易漏诊、误诊。X线、B超、CT、NMRI是临床常用的检测诊断技术，但是也都存在分辨率不够高的缺点。寻找方便、快捷、准确的癌症早期诊断方法意义重大，所以研究更先进的手段或者仪器来实现准确、及时的癌症早期诊断一直是人们努力的方向，也是广大医药工作者研究的热门课题。

纳米材料是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围(0.1～100nm)或由它们作为基本单元构成的具有特殊性能的材料。纳米材料自从被发现和合成以来就一直是人们关注的热点。由于其自身具备一些特殊性质为生物医学的研究提供了良好的平台，因此在最新的研究中，纳米材料在生物医学领域中的应用备受瞩目。纳米技术是研究纳米材料性质和应用的一门技术。目前科研人员通过该技术制成了药物、基因、生物大分子等载体，称之为纳米载体。纳米载体是一种新型、高效、稳定、特异性强的靶向载体，主要应用于生物医药领域。纳米载体具有多种形态：纳米微球(纳米粒)、纳米管、纳米片以及纳米多边形等。其中，纳米微球(纳米粒)是一种应用较为广泛的纳米载体。由于肿瘤所特有的病理生理变化，在肿瘤的诊断治疗中，纳米技术能更好地检测疾病所导致的分子和细胞改变。近年来，研发的纳米载体多用于癌症的靶向治疗，如靶向药物的运载，而在早期诊断方面的研发甚少，这也是目前相关生物技术领域中的研究前沿。

流式细胞术是借助流式细胞仪通过抗原抗体反应和荧光标记法完成对细胞各种特性进行定性定量的一种分析技术。自1977年Horan首次利用流式细胞仪将纳米高分子微球应用于免疫学检测以来，以纳米微球作为载体的生物检测技术已经渗透到细胞生物学、分子生物学、免疫学、医学等各个领域。由于流式细胞仪具有可根据微球粒径及所带特征荧光信号对微球进行特异性识别的能力，因此可利用纳米微球结合流式细胞术建立特异分子的检测技术。

近年来，研究人员发现量子点纳米粒具有生物发光特性，可以此作为标记载体，应用流式细胞术检测肿瘤，但是该方法只能检测出细胞表面特异性分子。二氧化硅纳米粒是极其重要的高科技超微细无机新材料之一，因其粒径很小、微孔多、比表面积大、表面吸附力强、分散性能好、稳定性佳等方面具有特异的性能，在众多学科及领域内独具特性，是一种具有广泛应用前景的无机纳米粒子。为此，本发明选用二氧化硅纳米粒子结合流式细胞术建立肿瘤相关胞内蛋白的检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用流式细胞术检测细胞胞内蛋白的方法，尤其是检测与肿瘤相关的胞内蛋白的方法，其包括如下步骤：

1.二氧化硅纳米粒的制备

(1)表面氨基化二氧化硅纳米粒的制备：

先采用法制备粒径为100～120nm的二氧化硅纳米粒，然后用γ-氨基丙基三乙氧基硅烷对二氧化硅纳米粒进行了表面修饰，得到表面氨基化的二氧化硅纳米粒；

(2)表面羧基化二氧化硅纳米粒的制备：

先采用法制备粒径为100～120nm的二氧化硅纳米粒，然后用硅烷偶联剂和丁二酸酐对二氧化硅纳米粒表面进行羧基化改性，得到表面羧基化的二氧化硅纳米粒；

2.具有结合胞内蛋白特异性二氧化硅纳米粒的制备：

(1)具有结合胞内蛋白特异性的表面氨基化二氧化硅纳米粒的制备：首先用质量分数为25％的戊二醛溶液活化步骤1中制备的100～120nm表面氨基化的二氧化硅纳米粒，再将活化后的纳米粒经磷酸盐缓冲液(PBS，NaCl 0.8g，KCl0.02g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，KH₂PO₄ 0.02g，H₂O 100ml，pH 8.0)清洗后重悬于PBS(pH 8.0)中形成2.5mg/ml的纳米粒悬液；