[发明专利]一种利用流式细胞术检测细胞胞内蛋白的方法

权利要求书

1.一种利用流式细胞术检测细胞胞内蛋白的方法，其步骤如下：

(1)制备粒径为100～120nm的表面氨基化或表面羧基化的二氧化硅纳米粒；

(2)具有结合胞内蛋白特异性二氧化硅纳米粒的制备

(a)具有结合胞内蛋白特异性的表面氨基化二氧化硅纳米粒的制备：首先用质量分数为25％的戊二醛溶液活化步骤(1)中制备的100～120nm表面氨基化的二氧化硅纳米粒，再将活化后的纳米粒经磷酸盐缓冲液清洗后重悬于磷酸盐缓冲液中形成2.5mg/ml的纳米粒悬液；

然后将上述纳米粒悬液与来源于小鼠的抗胞内蛋白的特异性抗体溶液混合，再在4℃轻轻搅拌过夜，真空冻干后得到具有结合蛋白特异性的表面氨基化二氧化硅纳米粒，其中纳米粒悬液与抗体溶液的体积比为2～5∶1；

(b)具有结合胞内蛋白特异性的表面羧基化二氧化硅纳米粒的制备：首先将步骤(1)制备的100～120nm表面羧基化的二氧化硅纳米粒用磷酸盐缓冲液重悬形成浓度为2.5mg/ml的悬液，之后用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺对纳米粒进行活化；

然后再将活化后的纳米粒悬液与来源于小鼠的抗胞内蛋白的特异性抗体溶液混合，再在4℃轻轻搅拌2h，真空冻干后得到具有结合胞内蛋白特异性的表面羧基化二氧化硅纳米粒，其中活化后的纳米粒悬液与抗体溶液的体积比为2～5∶1；

(3)肿瘤细胞胞内总蛋白的提取：将体外培养的人肿瘤细胞通过超声破碎裂解法获得肿瘤细胞胞内总蛋白溶液，浓度为100～200μg/ml；

(4)与肿瘤细胞胞内总蛋白的结合：将具有结合胞内蛋白特异性的二氧化硅纳米粒与获得的细胞胞内总蛋白溶液混合，用量比例为1mg∶200～400μl，4℃孵育30～60min，然后用磷酸盐缓冲液清洗2～3次，最后4℃、12000rpm离心5～10min得到与肿瘤细胞胞内总蛋白结合的纳米粒子；

(5)在步骤(4)中加入与步骤(2)中等浓度和体积的来源于兔的抗同一胞内蛋白的特异性抗体溶液混合，在4℃孵育30～60min；然后用磷酸盐缓冲液清洗2～3次，最后用磷酸盐缓冲液重悬该反应后的纳米粒，使其浓度为5mg/ml；

(6)在步骤(5)中加入荧光素标记的二抗溶液，其中加入的荧光素标记的二抗溶液与步骤(5)中反应后纳米粒悬液的体积比为1∶200～500，4℃避光孵育30～60min；然后用磷酸盐缓冲液清洗2～3次，之后用磷酸盐缓冲液重悬该反应后的纳米粒，使其终浓度约为1×10⁵个/ml，从而制备得到“二氧化硅纳米粒-抗体(鼠源)-肿瘤细胞胞内蛋白-抗体(兔源)-荧光素标记二抗”的实验组复合物；

(7)以1mg/ml牛血清白蛋白溶液替代步骤3中的肿瘤细胞胞内总蛋白，重复步骤(2)～(6)，从而制备“二氧化硅纳米粒子-抗体(鼠源)-牛血清白蛋白-抗体(兔源)-荧光素标记二抗”作为对照组复合物；

(8)利用流式细胞术对步骤(6)制备的“二氧化硅纳米粒-抗体(鼠源)-肿瘤细胞胞内蛋白-抗体(兔源)-荧光素标记二抗”复合物及步骤(7)制备的对照组复合物进行检测，从而实现对肿瘤细胞特异性胞内蛋白的定性检测。

2.如权利要求1所述的一种利用流式细胞术检测细胞胞内蛋白的方法，其特征在于：表面氨基化二氧化硅纳米粒的制备是采用法制备粒径为100～120nm的二氧化硅纳米粒，然后用γ-氨基丙基三乙氧基硅烷对二氧化硅纳米粒进行了表面修饰，得到表面氨基化的二氧化硅纳米粒。

3.如权利要求1所述的一种利用流式细胞术检测细胞胞内蛋白的方法，其特征在于：表面羧基化二氧化硅纳米粒的制备是采用法制备粒径为100～120nm的二氧化硅纳米粒，然后用硅烷偶联剂和丁二酸酐对二氧化硅纳米粒表面进行羧基化改性，得到表面羧基化的二氧化硅纳米粒。

4.如权利要求1所述的一种利用流式细胞术检测细胞胞内蛋白的方法，其特征在于：来源于小鼠的抗胞内蛋白的特异性抗体溶液为β-actin、Akt2或p-Akt1/2/3抗体的磷酸盐缓冲液溶液，抗体∶磷酸盐缓冲液的体积比为1∶200～1000。

5.如权利要求1所述的一种利用流式细胞术检测细胞胞内蛋白的方法，其特征在于：来源于兔的抗胞内蛋白的特异性抗体溶液为β-actin、Akt2或p-Akt1/2/3抗体的磷酸盐缓冲液溶液，抗体∶磷酸盐缓冲液的体积比为1∶200～1000。