[发明专利]从人干细胞中分离高活性干细胞的方法及由此分离的高活性细胞

说明书

技术领域

本发明涉及从人干细胞中分离高活性干细胞的方法、由该方法分离得到的干细胞以及含有该干细胞的细胞治疗剂和特定的培养基。

背景技术

干细胞能够分化成构成有机体组织的各种细胞，其通常指从胚胎、胎儿和成人组织中获得的未分化细胞。干细胞因特定的分化刺激(环境)而分化为特定的细胞；与已经停止细胞分裂的分化细胞不同，干细胞能够通过细胞分裂(自我更新)产生相同的细胞进行增殖(扩增)；其特点是分化的可塑性，即它们能在不同的环境或分化刺激下可分化为其他细胞。

干细胞主要分为胚胎干细胞(ES细胞)和多能性多能成体干细胞；胚胎干细胞从胚胎中获得，其属于多能干细胞，能够分化为所有类型的细胞；多能性多能成体干细胞从组织中获得。胚胎发育早期胚囊期的内细胞群将来发育为胎儿，而从内细胞群中分离出的胚胎干细胞理论上具有全能性，能够分化为构成有机体的每一种组织的细胞。也就是说，与成体干细胞不同，胚胎干细胞是未分化的细胞，其能够无限增殖，可分化为所有细胞种类，而且可通过形成生殖细胞而遗传给下一代。

人胚胎干细胞是通过分离和培养人胚囊的内细胞群而制备，全世界所有人胚胎干细胞的制备都源自经无菌处理后冷冻保存的胚胎。由于其具备可分化为所有细胞的多能性，这类细胞的特点为其可分化为每一种类型组织的细胞，而且可通过形成生殖细胞而遗传给下一代(Thomson等.，Science，282：1145-1147，1998；及Reubinoff等，Nat.Biotechnol.，18：399-404，2000)。

使用多能性人胚胎干细胞作为细胞治疗剂的各种方法仍然均未完全克服如致癌作用和免疫排斥等问题。

最近报道，间充质干细胞具有免疫调节作用并可成为解决这类问题的替代物。间充质干细胞是多能性细胞，可分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌细胞、神经细胞、心肌细胞等，据报道其具有调节免疫反应的作用。它们可从多种组织中分离，但是，根据其来源它们的能力和细胞表面标记彼此不同。因此，间充质干细胞目前确定能够分化为骨细胞、软骨细胞、肌细胞、螺旋状细胞，及SH2(+)、SH3(+)、CD34(-)和CD45(-)的基本细胞表面标记。

细胞治疗或细胞再生药物中必需的最小细胞数目为约1×10⁹。然而，还需要另外数量的细胞以进行实验确定条件和建立一个标准。就现有各种来源的间充质干细胞的情况，获得这个细胞数量至少需要转代培养10代。那么，这些细胞就会老化和改变，如此会使得它们不足以用于治疗。这是当前间充质干细胞培养系统所涉及的问题之一。此外，甚至当使用这些细胞确定了条件和标准后，在用于治疗之前这些细胞就被耗尽了。这种情况下，除了使用其他间充质干细胞外，就别无选择了，而使用不同的细胞还需要另外进行实验。因此，人们需要新方法以便有可能使用现有间充质干细胞作为治疗剂来解决上述问题。

韩国专利公开No.2008-3418教导了一种诱导胚胎干细胞成为胰细胞的方法，韩国专利No.10-593397公开了一种含有间充质干细胞和/或P物质的愈伤或促愈伤制剂，或细胞治疗剂。

发明概述

因此，本发明的设计满足上述需求，其目的是提供一种制备用于细胞治疗和细胞再生药物的细胞，该方法克服了以前离体培养扩增人干细胞的局限，保持对老化细胞恢复活力，应用于具有各种遗传背景的细胞。

根据本发明的一个方面，其提供用于从人干细胞中分离高活性干细胞的方法。

进一步地，根据本发明的另一个方面，其提供所述方法分离的高活性干细胞。

此外，根据本发明的另一个方面，其提供包含所述干细胞的细胞治疗剂。

再进一步地，根据本发明的另一个方面，其提供一种用于从人干细胞中分离高活性干细胞的特定培养基。

根据本发明，由于该方法可用于以前建立的间充质干细胞，以及目前提供的作为间充质干细胞来源的、其他不同条件培养的各种来源人间充质干细胞，该方法在研制细胞治疗剂方面非常有用。

附图说明

结合附图分别所示，通过以下描述，本发明的上述及其他目的和特征将更加明显：

图1：该照片显示由本发明方法产生的干细胞球。

图2：对本发明方法分离的干细胞，通过荧光激活细胞分选法(FACS)做细胞周期测定，其证实了表明旺盛增殖的S(合成)期增长。

图3：本发明方法分离的干细胞的细胞因子分泌测定，其显示IL-6、GM-CSF、VEGF、HGF、IL-8、IFN-g和bGFG的大幅增长。

图4：通过本发明方法增强干细胞特性，其显示OCT-4和E-钙粘连蛋白作为多能细胞标记的增长。