[发明专利]抗谷氨酸脱氢酶蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用无效
| 申请号： | 200910205503.1 | 申请日： | 2009-10-20 |
| 公开（公告）号： | CN101805723A | 公开（公告）日： | 2010-08-18 |
| 发明（设计）人： | 王淑杰;蔡雪辉;徐敏;武佳斌;刘永刚;石文达;李丽琴;徐明明;荣福龙 | 申请（专利权）人： | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 |
| 主分类号： | C12N5/20 | 分类号： | C12N5/20;C07K16/40;G01N33/577;A61K39/40;A61P31/04;C12R1/91 |
| 代理公司： | 北京科龙寰宇知识产权代理有限责任公司 11139 | 代理人： | 孙皓晨;费碧华 |
| 地址： | 150001 黑龙*** | 国省代码： | 黑龙江;23 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 谷氨酸 脱氢酶 蛋白 单克隆抗体 及其 制备 方法 应用 | ||
【说明书】：
技术领域
本发明涉及单克隆抗体，尤其涉及抗谷氨酸脱氢酶(GDH)蛋白单克隆抗体及其制备方法，本发明还涉及抗GDH蛋白单克隆抗体在诊断或防治猪链球菌中的应用，属于猪链球菌病的诊断或防治领域。
背景技术
猪链球菌(Streptococcus suis)是一种重要的人畜共患病病原体，猪群对此病普遍易感，感染后可有急性败血症、肺炎、脑膜炎、关节炎、心内膜炎及急性死亡等多种临床类型，如不及时治疗死亡率可达40％甚至更高；耐过的猪生长缓慢，存栏时间大为延长。人类感染该菌，可导致脑膜炎，引发永久性耳聋、败血症、心内膜炎，甚至死亡。猪链球菌的种类繁多，到1995年已鉴定出35个荚膜血清型(1～34型及1/2型)，其中1/2、1、2、7、9型分离频率较高，其类型的分布具有明显的地理差异。不同型甚至同一型的不同分离株致病性也有很大差异，这与其毒力因子密切相关。由猪链球菌引发的猪链球菌病在所有养猪业发达的国家均有报道，在我国的危害也日益加大。就世界范围来说，猪链球菌2型是最流行的一种血清型，也是普遍认为致病性最强的一种血清型。近年来，猪链球菌在我国很多省区时有流行或暴发，对集约化养猪造成重大损失，在本发明人实验室近年分离的猪链球菌中发现有一株血清型7型的猪链球菌比分离到的1型2型9型致病力强，故本发明人针对这一菌株展开相应的研究。
猪链球菌病在我国被列为二类法定传染病。传统的病原分离镜检、生化试验和玻片凝集试验是目前世界各国普查及贸易检疫最常用的方法。病原分离镜检、生化试验和玻片凝集试验操作简单，实验条件要求不高，是我国目前主要采用的检疫方法，但结果判定主观性较强，不易量化，易发生漏检或假阳性。上述技术诊断抗原均直接采用猪链球菌菌体本身或提取物培养物，生产与制备过程涉及活菌培养，存在一定的生物安全危险，必须采取严格的生物安全措施，大大提高了生产制备成本；同时，菌体抗原组成复杂，与其他种属细菌存在一定的抗原性交叉，导致假阳性发生。利用生物技术研制安全廉价、敏感特异、能够替代细菌培养物的重组蛋白抗原，具有重要意义。
GDH蛋白是猪链球菌的谷氨酸脱氢酶(glutamatedehydrogenase，GDH)，是连接碳代谢和氮代谢的一个关键酶，是细菌能量代谢过程中的一个十分重要的功能分子，对细菌致病性有着重要意义，GDH存在于所有的猪链球菌菌株中，也是Okwuma bua等于2001年发现的一个与SS2毒力相关的因子，GDH蛋白在抗原性上具有较好的猪链球菌种属特异性。猪链球菌的谷氨酸脱氢酶属于GDH蛋白家族，其氨基酸序列与存在于各个物种中的谷氨酸脱氢酶蛋白(GDH)的序列相似，都包括保守基序和典型的GDH1型家族的功能区域，在细胞表面表达，酶活性是NAD(P)H依赖型的，作用底物为L-谷氨酸，其编码基因在SS2中保守存在。有研究表明，SS2的GDH有保守的抗原性，能与感染有猪链球菌的猪的血清反应，可作为检测猪链球菌的重要标志性抗原，基于GDH蛋白的检测可区分SS2的强毒株、弱毒株和无毒株。有试验证明将GDH表达的产物进行酶活性测定，结果表明猪链球菌的GDH是NADP(H)特异性酶，它能利用NADPH作辅酶催化α-酮戊二酸合成L-谷氨酸，且活性较高，而催化L-谷氨酸生成α-酮戊二酸的活性较弱(Benachenhou-Lahfa N，Forterre P，Labedan B.Evolution of glutamatedehydrogenase genes：evidence for two paralogous proteinfamilies and un-usual branching patterns of thearchaebacteria in the universal tree of life[J].MolEvol，1993，36：335-346.)。总之，目前国内外对GDH的研究都是仅针对SS2的报导。
猪链球菌导致猪患疫病，并可感染人患脑膜炎和败血症，甚至引起死亡，在世界许多国家均受到重视。猪链球菌病传播快、潜伏期短、死亡率高，故快速和准确地对该菌进行分型对于该病的诊断、治疗、预防及流行病学调查等方面有重要意义。但由于该菌类型多样，毒力因子复杂不一，且各毒力因子的致病机理和相互作用与关系仍未明确，对该病的诊断和防治仍缺乏有效手段，现有的各种检测方法尚不能满足临床需求，因此如何建立快速和准确的分型方法有待继续探究。
发明内容
本发明目的之一是提供能够分泌抗猪链球菌谷氨酸脱氢酶蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系；
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- 2016-04-12 - 2019-10-08 - C12N5/20
- 一种牛妊娠相关糖蛋白PAG特异性单克隆抗体细胞株，其特征在于：所述菌株的登记入册保藏编号为CGMCC No. 12034，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年1月27日。菌株PAG109在检测牛怀孕妊娠的应用，可以用来快速检测牛怀孕妊娠。
- 一株甲霜灵单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用-201810934313.2
- 胥传来;林璐;匡华;徐丽广;马伟;刘丽强;吴晓玲;宋珊珊;胡拥明 - 江南大学
- 2018-08-16 - 2019-10-01 - C12N5/20
- 一株甲霜灵单克隆抗体杂交瘤细胞株20170507及其应用，属于食品安全免疫检测技术领域。本发明甲霜灵完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化完全，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。首次免疫（100μg/只）用完全弗氏佐剂，多次加强免疫（50μg/只）用不完全弗氏佐剂，最后一次用甲霜灵完全抗原（25μg/只，不含佐剂）冲击免疫。取高效价的IC50小鼠的脾细胞，通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，经过间接竞争酶联免疫法筛选和三次亚克隆，得到甲霜灵单克隆抗体杂交瘤细胞株20170507。此细胞株分泌的单克隆抗体，对甲霜灵具有较好的特异性和检测灵敏度（IC50值为40 ng/mL），为食品中甲霜灵残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。
- 一株抗呋喃苯烯酸钠单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用-201810934315.1
- 匡华;吴爱红;胥传来;徐丽广;马伟;刘丽强;吴晓玲;宋珊珊;朱建平 - 江南大学;无锡迪腾敏生物科技有限公司
- 2018-08-16 - 2019-10-01 - C12N5/20
- 一株抗呋喃苯烯酸钠单克隆抗体杂交瘤细胞株SS0716及其应用，属于食品安全免疫检测技术领域。本发明制备的抗呋喃苯烯酸钠单克隆抗体杂交瘤细胞株SS0716，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14686，保藏日期为2017年9月5日。抗呋喃苯烯酸钠单克隆抗体，由所述保藏编号为CGMCC No.14686的杂交瘤细胞株SS0716所分泌产生。此细胞株分泌的单克隆抗体，对呋喃苯烯酸钠（NSOD）具有较好的特异性和检测灵敏度（IC50值为0.38μg/L），可以用于食品安全中呋喃苯烯酸钠的检测。
- 抗邻苯二甲酸二乙酯单克隆抗体杂交瘤细胞株及其构建方法-201910299968.1
- 周勇;程金平;黄烯茜;张佳琪;廖浩祥;付双;张哲;胡雪;梁珊 - 上海交通大学
- 2019-04-15 - 2019-09-24 - C12N5/20
- 本发明提供一种抗邻苯二甲酸二乙酯单克隆抗体杂交瘤细胞株及其构建方法；所述构建方法包括人工抗原的合成、小鼠免疫、杂交瘤细胞的筛选及建株、单克隆抗体的制备纯化及效价测定。所述人工抗原的合成包括免疫抗原、检测抗原的合成，所述杂交瘤细胞的筛选及建株包括SP2/0细胞的收集、脾细胞的收集、细胞融合、融合板的检测等步骤。本发明的制备方法简单，免疫效果好；能获得稳定分泌抗邻苯二甲酸二乙酯单克隆抗体的杂交瘤细胞株，为水环境中邻苯二甲酸二乙酯的免疫学快速检测方法的建立提供研究基础。
- 一株吉他霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株SML及其应用-201910565378.9
- 胥传来;郭玲玲;匡华;徐丽广;马伟;刘丽强;吴晓玲;宋珊珊;胡拥明 - 江南大学
- 2019-06-27 - 2019-09-20 - C12N5/20
- 本发明涉及一株吉他霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株SML及其应用，属于食品安全免疫检测领域。杂交瘤细胞株SML，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.17392。本发明将吉他霉素的完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化，免疫BALB/c小鼠。首次免疫用完全弗氏佐剂，多次加强免疫用不完全弗氏佐剂，最后用吉他霉素完全抗原冲刺免疫。将高效价，低IC50小鼠的脾细胞，通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，培养，筛选；再经过间接竞争酶联免疫法筛选细胞并三次亚克隆，最终得到一株单克隆抗体杂交瘤细胞株。此细胞株分泌的单克隆抗体，对吉他霉素具有较好的特异性和检测灵敏度，可实现对水产品中吉他霉素残留量的检测，具有实际应用价值。
- 一种鸭坦布苏病毒NS1蛋白单克隆抗体及其识别的B细胞表位及其应用-201610394584.4
- 刁有祥;提金凤;陈浩;唐熠;李志杰 - 山东农业大学
- 2016-06-03 - 2019-09-20 - C12N5/20
- 本发明提供了一株分泌鸭坦布苏病毒NS1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株、其分泌的单克隆抗体及其鉴定的TMUV‑NS1蛋白的TMUV特异性细胞表位。本发明利用TMUV NS1蛋白制备了单克隆抗体，利用单克隆抗体筛选鉴定了1个NS1蛋白的B细胞表位269DEKEIV313，该表位具有高度的保守性和特异性，可用于TMUV多肽疫苗的研制及特异性血清学方法的建立等方面。
- 抗鹅CD8α链胞外区单克隆抗体及其在检测禽类外周血中CD8+T淋巴细胞中的应用-201610244264.0
- 马波;曹春秋;张雪莲;王君伟;张文龙;高明春;张文晶;崔嘉琦 - 东北农业大学
- 2016-04-19 - 2019-09-17 - C12N5/20
- 本发明公开了抗鹅CD8α链胞外区单克隆抗体及其在检测禽类外周血中CD8+T淋巴细胞中的应用。本发明以携带鹅CD8α链胞外区基因的原核表达载体为模板，设计1对特异性引物扩增得到鹅CD8α链胞外区238‑480bp基因，构建重组原核表达载体，采用大肠杆菌表达鹅CD8α链胞外区80‑160aa，得到重组蛋白rGopET‑30a‑CD8αex。以重组蛋白rGopET‑30a‑CD8αex为免疫原，免疫小鼠，经筛选获得1株稳定分泌抗鹅CD8α链胞外区80‑160aa单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为9E4，保藏号是：CGMCCNO.11194。研究表明，该单克隆抗体能与纯化的重组鹅CD8α链胞外区80‑160aa蛋白反应，同时也能够与分离的鹅、鸭以及鸡的外周血淋巴细胞发生特异性反应。因此，本发明的提出为检测禽类外周血中CD8+T淋巴细胞提供了一种新的、有效的技术手段。
- 一种分泌抗蓝舌病病毒NS3蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞-201810180525.6
- 高林;李乐;李华春;何于雯;朱建波;苗海生;肖雷;杨恒;谢佳芮;廖德芳;李楠;孟锦昕 - 云南省畜牧兽医科学院
- 2018-03-05 - 2019-09-13 - C12N5/20
- 本申请属于生物技术领域，涉及但不限于一种分泌抗蓝舌病病毒NS3蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。本申请利用蓝舌病血清1型病毒作为免疫原，得到能够分泌对蓝舌病病毒具有群特异性的单克隆抗体的杂交瘤细胞株及由其分泌的单克隆抗体。本申请产生的单克隆抗体能够取代兔源蓝舌病病毒抗体与蓝舌病病毒NS3蛋白结合。
- 专利分类
