[发明专利]具有高体内活性的降血压肽及其制备和纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种具有高体内降血压作用的螺旋藻降血压肽的制备、纯化方法，可应用于保健性功能食品及药品领域。

背景技术

目前全世界有将近十亿人口患高血压，高血压正成为严重威胁人类健康的疾病之一。虽然卡托普利(Captopril)等人工合成血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂具有显著的降血压效果，然而这类降血压药物属酶的竞争性抑制剂，它们对酶活性部位的抑制是可逆的，药物作用时间不长，停药后会使血压反弹；而且，这类药物被吸收和排泄的速度较快，经肾脏排出易损害肾功能，同时也会引起诸多的副作用，例如咳嗽、过敏、皮疹、水肿、心律失常和肾脏损害等，所以研发更为安全的天然来源ACE抑制剂十分必要。

ACE抑制肽的研究在国外从上世纪六、七十年代开始，而在国内则从九十年代后期开始才逐有报道。国内外研究者已从不同的天然食物来源中分离出ACE抑制肽，如蝮蛇、牛奶、金枪鱼、酪蛋白等，不同来源的ACE抑制肽在氨基酸数目、序列和活性上均存在较大差异。

螺旋藻为蓝藻的一个属，含有多种营养成分，具有营养及医疗保健功能，被世界粮农组织(FAO)誉为21世纪人类最理想、最完美的食品。螺旋藻中尤以蛋白质含量最为丰富，是大豆蛋白质的两倍，是目前已知植物中蛋白质含量最高的一种，其中含有18种氨基酸，其中包括人体必需的全部8种氨基酸，是获得天然活性肽的潜在宝贵资源，但高纯度和高活性的螺旋藻源ACE抑制肽目前在国内外尚无报道。此外，螺旋藻主要以干粉形式直接应用食品行业，由于其溶解性质的局限性，不利于人体吸收，使其应用受到一定的限制。本研究采用3种不同种类的 酶及酶解提取、精制技术，获得了9种ACE抑制肽，其中缬氨酸(valine)-谷氨酸(glutamic acid)-脯氨酸(proline)(Val-Glu-Pro，VEP)肽IC50＝27.36±0.14μM，Ki＝23.59±0.54μM，其成果可广泛应用于保健性功能食品及药品领域，具有巨大的实用价值和经济效益。

发明内容

本发明的目的是克服大分子蛋白质吸收性差以及目前活性肽品种混杂不清、活性和纯度不高方面的不足，获得一种具有高体内降血压作用的螺旋藻降血压肽的制备方法。

为实现上述目的，本发明采用超低温冻融与超声波破碎相结合的方法从螺旋藻粉末中提取蛋白，再利用木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶或嗜热菌蛋白酶进行不同条件的酶解，将以上3种酶水解所获产物经不同分子量大小的超滤膜MWCO 10000、5000、3000过滤，获得具有不同分子量多肽的滤液，以体外ACE抑制活性为指标，通过凝胶过滤色谱、反相高效液相色谱对所提取多肽进行纯化，纯化后的多肽使用PPSQ-31A/33A系列全自动蛋白多肽序列分析仪和Kratos Analytical Shimadzu质谱分析仪进行鉴定。活性肽的体内降血压效果通过动物实验进行验证，并应用分子生物学和免疫学等手段检测相关调控因子的基因和蛋白表达，分析其体内作用机制，证实具有良好的体内降血压效果，可应用于保健性功能食品及药品领域。

此种具有高体内降血压作用的螺旋藻降血压肽的制备，也可利用肽自动合成仪通过多肽合成方法人工合成。

附图说明

下面对附图进行简要说明。

图1是Superdex Peptide HR 10/30凝胶过滤色谱图。横坐标轴表示分离各管的试管号，纵坐标表示各管在220nm处的吸光度值。

图2是Cosmosil MS-II C18柱反相高效液相色谱图，(a)表示第一次分离曲线图，(b)表示第二次分离曲线图。横坐标轴表示分离各管的试管号，纵坐标轴表示各管在220nm处的吸光度值。

图3是ACE抑制肽的质谱图。

图4是抑制剂类型图。(a)表示Lineweaver-Burk图，横坐标轴表示基质浓度的倒数，纵坐标轴表示反应速度的倒数；(b)表示Dixon图，横坐标轴表示抑制剂的浓度，纵坐标轴表示反应速度的倒数。

图5是Hydrosphere C18柱反相高效液相色谱图。(a)表示未经消化酶消化的色谱图，(b)表示经胃蛋白酶消化的色谱图，(c)表示经胰凝乳蛋白酶消化的色谱图，(d)表示经胰蛋白酶消化的色谱图，(e)表示经胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶及胰蛋白酶消化的色谱图。横坐标轴表示时间，纵坐标轴表示吸光度值。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述，但并不限制本发明的范围。其具体工艺路线由以下步骤构成：