[发明专利]中国黄牛成熟叠朊蛋白及其多克隆抗体的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种采用基因工程方法制备一种抗原蛋白和用这种蛋白制备免疫抗体的方法，以及这种蛋白和相应抗体的用途，更确切讲，本发明涉及制备中国黄牛成熟叠朊蛋白及其多克隆抗体，以及这种蛋白和抗体的用途。

背景技术

尽管诺贝尔奖获得者Prusiner SB的“唯蛋白”理论指出，疯牛病、痒病和人变异性克雅氏病等传染性海绵状脑病(Transmissible SpongiformEncephalopathy，TSE)是由一种不含有核酸的蛋白质----朊病毒(Scrapie PrionProtein，PrP^Sc)导致的，但是其发病机理至今仍不清楚。PrP^Sc是由PrP^C(Cell PrionProtein，细胞型朊蛋白)构象发生转变后产生的，但是其转换机制尚不清楚。近年来的研究表明，与PrP^C结构相似的一种蛋白质----叠朊蛋白(Dopple，Dpl)与TSE的发病息息相关。Dpl是由Prnd基因编码的约179个左右氨基酸残基组成的糖蛋白，它是PrP^C的横向同源物，两者翻译后的修饰和空间结构非常相似。Dpl主要在睾丸中表达，在中枢神经系统的表达量很低。Dpl体现两个方面的功能：一是生殖功能，敲除Prnd基因的雄性小鼠丧失了生育能力；另一方面是神经功能，因为敲除PrP^C编码基因的小鼠没有出现明显的神经和精神症状，所以，学者推测Dpl可能具有部分替代PrP^C功能的作用。但是另一方面，研究又表明Dpl具有神经毒性作用，在脑组织中过量表达Dpl会导致小鼠出现共济失调现象。有趣的是PrP^C会将小鼠从Dpl诱导的共济失调中拯救出来，这表明PrP^C通过直接与Dpl作用或者通过共配体或者共受体的方式中和了Dpl的神经毒性作用。这些研究意味着Dpl与PrP^C、甚至与PrP^Sc可能有着密切的关系，但是目前它们间的相互作用关系尚不清楚。所以，通过各种手段了解Dpl的结构与功能对阐明Dpl在TSE发病中的作用具有重要意义。抗体是研究蛋白质结构与功能的重要工具，因此，制备出针对Dpl的相应抗体对深入研究Dpl具有重要意义。

Dpl是一种糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的膜蛋白，其前体形式是由氨基端的信号肽(牛Dpl信号肽为1-26位氨基酸残基)、中间的成熟Dpl(牛成熟Dpl为从第27位至第155位氨基酸残基组成)和羧基端的GPI结合区(牛Dpl该区从第156位至第179位氨基酸残基组成)组成。Dpl的ORF位于一个单一的外显子内，其编码的Dpl前体在蛋白质的翻译后修饰过程中切除了氨基端信号肽和羧基端GPI结合区的氨基酸残基，添加上GPI锚，形成成熟Dpl，主要分布在睾丸组织中。由于直接制备来源于牛睾丸组织的Dpl，不仅受材料限制，而且获得的量很少，不易纯化。所以，以牛睾丸组织为实验材料不利于免疫原制备。

在抗牛Dpl多克隆抗体(以下简称为多抗)制备方面，国外学者制备出了针对本土牛Dpl的多抗，应用于Dpl的免疫印迹(Western Blotting)、免疫组化等方面。研究表明，中国黄牛Dpl的编码基因BoPrnd(在GenBank中的登录号为DQ408532)的开放阅读框(ORF)为537bp，与GenBank登录的国外其它牛Prnd的ORF的最高同源性为99％(534/537)，例如DQ205538，NM174158和BTA278011序列，分别在第149、395和438位发生G→A，G→A和C→G的改变，相应地引起氨基酸发生了R(精氨酸)50H(组氨酸)，H(组氨酸)146Q(谷氨酰胺)的改变。发生改变的这两个氨基酸位于牛成熟Dpl内，这表明中国黄牛成熟Dpl的氨基酸序列不同于国外本土牛的成熟Dpl氨基酸序列。所以，不使用牛睾丸组织获得中国黄牛成熟Dpl，以及制备针对中国黄牛成熟Dpl的多抗，对研究中国黄牛Dpl的结构与功能具有一定意义，能够为研究工作提供有力实验工具，并对中国畜牧业的发展产生积极的作用。但现阶段尚缺乏这方面的披露。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种中国黄牛成熟叠朊蛋白的制备方法和由此方法得到的中国黄牛成熟叠朊蛋白，本发明的目的之二是提供中国黄牛成熟叠朊蛋白的多克隆抗体的制备方法以及这种多克隆抗体，本发明的目的之三是提供中国黄牛成熟叠朊蛋白和中国黄牛成熟叠朊蛋白多克隆抗体的用途。