本发明公开了一种干酪乳杆菌鼠李糖亚种的亚硝酸盐还原酶的制备方法,首先将干酪乳杆菌鼠李糖亚种(Lactobacillus casei subsp rhamnosus)6013进行含亚硝酸盐还原酶的诱导培养,破壁时加入酶保护剂提取亚硝酸盐还原酶粗酶,再进行真空冷冻干燥后,依次经阴离子交换层析和/或葡聚糖凝胶层析,最后制得纯亚硝酸盐还原酶,从干酪乳杆菌鼠李糖亚种中提取的NiR的活力高,NiR降解亚硝酸盐的条件简单;本发明所公开的条件可使NiR的酶活损失少,得到的NiR纯度高,NiR可以解决蔬菜发酵、肉制品和养殖水体等3个领域中含亚硝酸盐的问题。