[发明专利]一种食品级降解乙醇枯草杆菌重组菌的构建方法

摘要

本发明涉及一种食品级降解乙醇的枯草杆菌重组菌的构建方法，属于生物技术领域。乙醇经乙醇脱氢和乙醛脱氢酶的作用下可以转化为对人体相对无毒的乙酸。本发明公开的重组枯草杆菌的构建方法，通过双交换同源重组的方法将两个酶基因的表达盒整合至枯草杆菌的基因组上，实现了乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的胞内共表达，且满足食品级重组微生物的要求。该重组枯草杆菌可以在低pH条件下降解乙醇，可作为口服制剂“帮助”人体代谢部分酒精，起到解酒护肝的作用，在解酒保健品领域具有广阔的应用前景。

主权项

1.一种食品级降解乙醇的枯草杆菌重组菌构建方法,其特征在于，是一种食品级可降解乙醇的胞内共表达乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的重组枯草杆菌的构建方法，包含以下构建步骤：/n(1)整合型乙醛脱氢酶胞内表达载体的构建，包括扩增上下游同源臂、启动子和目的基因，回收扩增产物，采用重叠延伸PCR的方法将基因片段连接，再与整合型质粒连接，转化大肠杆菌感受态细胞，氨苄青霉素抗性平板筛选得到乙醛脱氢酶整合型胞内表达载体，所述整合型质粒是含有启动子、乙醛脱氢酶基因和整合位点细胞壁相关蛋白酶wprA同源序列的整合型质粒；/n(2)整合型乙醇脱氢酶胞内表达载体的构建，包括扩增上下游同源臂、启动子和目的基因，回收扩增产物，采用重叠延伸PCR的方法将基因片段连接，再与整合型质粒连接，转化大肠杆菌感受态细胞，氨苄青霉素抗性平板筛选得到乙醇脱氢酶整合型胞内表达载体，所述整合型质粒是含有启动子、乙醇脱氢酶基因和整合位点蔗糖水解酶sacA同源序列的整合型质粒；/n(3)胞内表达乙醛脱氢酶的枯草杆菌的构建：/n1)重组质粒的转化：将测序验证正确的乙醛脱氢酶整合型胞内表达载体转化枯草杆菌168化学感受态细胞，涂布红霉素抗性平板，37℃过夜培养，PCR检测验证转化子，能检测到istALDH片段1578bp即为阳性克隆；/n2)重组菌株的筛选：pCBS质粒是大肠杆菌和枯草杆菌的温敏型穿梭质粒，含有革兰氏阳性菌的温度敏感型复制起始位点——在37℃条件下，可在宿主菌中进行自主复制，当温度升高至42℃时，则无法进行自主复制。/n将含有istALDH片段的阳性克隆在42℃，180rpm培养24小时后涂布LB平板，42℃培养得到单菌落，诱导第一次重组，第一次重组在wprA-up位置发生，得到的单菌落基因组出现wprA up-P